产表面活性剂菌株（QS―M2）的筛选及其特性研究.docVIP

产表面活性剂菌株（QS―M2）的筛选及其特性研究 　　摘要：从大庆油田油水采出液中经富集培养、划线分离、溶血圈测定和苯酚硫酸检测等方法筛选出一株产表面活性剂的菌株QS―M2，经生理生化分析和16S rDNA分子生物学鉴定，确定菌株Qs?M2为铜绿假单胞菌，提取其代谢产物经薄层层析和HPLc―Ms鉴定表明：主要的表面活性剂物质是鼠李糖脂类物质，其中单鼠李糖脂的主要组分为RhaC10、RhaC12：C12双鼠李糖脂的主要组分为Rha2C14CC12、Rha2C10C12和Rha2C10C10，该菌株产生的鼠李糖脂可将上清液的界面张力由72.0mN/m降至36.9mN/m，且鼠李糖脂的乳化性能较好，在72 h内乳化性能稳定，结果表明，鼠李糖脂类表面活性剂物质是Qs-M2菌株在微生物提高原油采收率过程中发挥作用的主要因素， 　　关键词：生物表面活性剂；菌株筛选；界面张力；乳化性能；鼠李糖脂 　　DoI：10.15938/j.jhust.2016.04.012 　　中图分类号：TQ920.6 　　文献标志码：A 　　文章编号：1007-2683（2016）04-0065-05 　　0引言生物表面活性剂是由微生物产生的一类严格集亲水基团和疏水基团于一体的具有表面活性的化学物质与化学表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有润湿、乳化、分散、洗涤、起泡、增溶等功能外，还具有低毒性、可降解性和环境友好性、高效性等性能，在石油、环境保护、食品和医药、化妆品、洗化用品等诸多领域具有广泛的应用前景大量研究已经证明，利用微生物产生的生物表面活性剂能够有效的提高原油采收率其主要作用机理是降低油水界面张力，乳化原油，形成水包油的乳化液，提高岩石的亲水性能，然而，在一般的生产过程中，由于生物表面活性剂产量低、生产成本高、纯化工艺复杂，所以目前生物表面活性剂没有大规模的生产采用原油为唯一碳源筛选产生物表面活性剂的微生物菌株，经过驯化得到高效产生物表面活性剂的菌株，不仅降低生产成本而且适应油田环境，可以产生更好的驱油效果。 　　产生物表面活性剂的微生物主要是细菌和酵母菌，微生物代谢的目前最有效的生物表面活性剂是鼠李糖脂类，其产生菌多为假单胞菌属，假单胞菌属产生的鼠李糖脂的亲水基团一般由1-2分子的鼠李糖构成，疏水基团则由1-2分子具有不同碳链长度的脂肪酸构成，在生物合成过程中，这些基团之间可能相互链接而生成多种化学结构相近的同系物，鼠李糖脂组分的鉴定是阐述鼠李糖脂采油性能的前提和基础，而糖脂类物质的成分鉴定方法则从简易的利用鼠李糖脂水解后测定鼠李糖的色度逐渐发展为利用高效液相色谱一质谱联用、核磁共振等分析样品组成的复杂方法Mata-Sandoval等则利用高效液相色谱法分析得到了由铜绿假单胞菌UG2所产生的鼠李糖脂的主要组成为RhC10Rh2C10C12H2、RH2C10C12和Rh2C10C10，目前，高效液相色谱一质谱联用被认为是目前对鼠李糖脂组分研究最精确的方法之一， 　　本研究从大庆油田油藏采出液中筛选出一株高产糖脂类生物表面活性剂的菌株QS-M2，对QS-M2菌株进行生理生化分析和分子生物学鉴定；利用薄层层析实验和HPLC，MS方法对提纯的鼠李糖脂组分进行了鉴定和表征；同时，通过对糖脂类物质产量、界面张力、乳化性能等指标的测定，分析了筛选菌株的采油潜力。 　　1.材料和方法 　　1.1样品来源 　　样品来自于大庆油田采油三厂油藏采出液， 　　1.2培养基 　　LB液体培养基（g/L）：蛋白胨1%，酵母粉0，5%，NaCI1%，pH 7.0.LB固体培养基（g/L）：LB液体培养基基础上加1.5%琼脂粉，制成平板，石油液体培养基（g/L）：原油5%，NaCl0.21%，NH4cl0.07%，N%HPO412%，KH2PO40.07%，酵母粉0.6%，MgSOC40.5%，pH7.0，血平板培养基：购自北京奥博星生物技术有限责任公司。 　　1.3菌株的筛选和鉴定 　　1.3.1菌种富集、分离纯化 　　菌种富集、分离纯化参照文将100 mL石油液体培养基加入250 mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，样品接种量为3%，37°C150 rpm培养48 h至培养基浑浊，采用平板划线法进行菌种的分离纯化，将所鉴定的纯菌划线至斜面，37℃培养1 d，4～C保存备用。 　　1.3.2产糖脂类菌株的筛选 　　1）产生物表面活性剂菌株的初筛，挑取单菌落接人5mL LB液体培养基，37°C150 rpm培养24h取1mL菌液4°C 12000 rpm离心除菌后，取上清10UL滴在血平板上，37°C培养24 h，观察透明溶血圈的出现筛选产表面活性剂的菌种。 　　2）苯酚硫酸法筛选产糖脂类菌株，发酵上清液加人0，5 mL 6%苯酚溶