酶学技术2016.ppt

肝素 标本不能溶血 及时分离 及时测定 尽量选择血清标本 不能冷冻 一、标本因素的影响 溶血、 抗凝剂 、 存放条件 二、测定条件的影响 波长 样品量与试剂 稀释水量 反应时间 孵育时间 延迟时间 检测时间等 三、方法因素对测定结果的影响 四、最适条件的选择与确定 采用了两个不同的波长即测量波长（又叫主波长λp, Primary Wavelength）和参比波长（又叫次波长λs, Second Wavelength）同时测定一个样品溶液，以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。 波长 样品量与试剂 样品与反应液总量的比例一旦选定,就不要随意更改. 稀释水量 反应时间 孵育时间 延迟时间 检测时间 一、标本因素的影响 溶血、 抗凝剂 、 存放条件 二、测定条件的影响 波长 样品量与试剂 稀释水量 反应时间 孵育时间 延迟时间 检测时间等 三、方法因素对测定结果的影响 正向反应与逆向反应 测定的底物与产物 定时法与连续检测法 启动模式 四、最适条件的选择与确定 * 单试剂法：反应体系中只加一种试剂的方法。 双试剂法：为消除一些干扰和非特异反应，提高检测结果的准确性，在反应过程中试剂分开配制和加入反应体系。 一、标本因素的影响 溶血、 抗凝剂 、 存放条件 二、测定条件的影响 波长 样品量与试剂 稀释水量 反应时间 孵育时间 延迟时间 检测时间等 三、方法因素对测定结果的影响 正向反应与逆向反应 测定的底物与产物 定时法与连续检测法 启动模式 四、最适条件的选择与确定 底物 缓冲液 温度 辅酶和辅基 激活剂和抑制剂 工具酶 延滞期和线性期 样品与试剂 * 第六节诊断酶学在临床上的应用 一、血浆酶的来源 血浆酶 血浆特异酶 非血浆特异酶 外分泌酶 细胞内酶 * 二、血液中酶浓度的变化机制 1 、合成异常 2 、从损伤细胞中释放增加（影响酶释放速度和数量的因素） 3 、清除异常 4 、其他影响 三、临床常用的血清酶 * * * * * （二）线性期 特点：可代表酶促反应速度 最大反应速度期，是测 定酶活性最佳时期，持续时间1－5min。此期反应速度与底物浓度无关，而与酶活性成正比。 线性期（零级反应期）： 概念：酶促反应速度达到最大并保持恒定速度进行反应的时期 * （三）非线性期（偏离线性期、平坦期 ） 进入非线性期的原因： 反应的不断进行，底物消耗越来越多，可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。 特点： 若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方 成正比，为一级反应。 * 酶学分析技术的应用 第二节 酶活性测定方法 第三节 代谢物酶学分析技术 * 酶测定 绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法 相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法 E E 第二节 酶活性测定方法 * 一、定时法 原理： 定时法是固定时间法的简称，是指底物与酶反应一段时间（t1～t2）后,加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应,测定这段时间内产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。 特点： 优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。 缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。 吸光度A t1 t2 　　 时间t 　　　 图5-6　定时法的三种反应进程 2 3 1 二、连续监测法 原理： 连续监测法是指在酶促反应的线性期每间隔一定时间测定一次产物或底物的变化量,根据其变化量间接求出酶活性浓度，因是测定产物或底物随时间的变化量又称速率法。 概 念 与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应； 标本和试剂用量少，可在短时间内完成测定； 连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生色原显色法； 要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求 。 特 点 无需停止酶促反应 不需添加其他呈色试剂 在线性期测定酶活性 标本和试剂用量少 可在短时间内完成测定 连续观测反应进程 对仪器要求高 （一）直接法 指直接测定酶促反应产物或底