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《烟用添加剂中对乙氧基苯脲的测定 高效液相色谱法》 实验报告 云南烟草科学研究院 二○一二年二月九日  目 录 1 前言 4 1.1 对乙氧基苯脲简介 4 1.2 理化性质 4 1.3 检测方法综述 4 1.3.1 薄层色谱法 4 1.3.2 分光光度法 5 1.3.3 气相色谱法 5 1.3.4 毛细管电泳法 5 1.3.5 液相色谱法 6 1.4 小结 7 2 标准适用范围 8 3 原理 8 4 试验方法 8 4.1 仪器 8 4.2 试剂与材料 8 4.3 试样前处理 9 4.4 高效液相色谱条件 10 4.5 标准曲线制作 10 4.6 试样测定结果 11 5 结果与讨论 11 5.1 色谱条件的选择 11 5.1.1 检测器及波长的选择 12 5.1.2 色谱柱的选择 16 5.1.3 流动相的选择 19 5.1.4 其它色谱条件的选择 22 5.2 前处理步骤的选择及优化 22 5.2.1 空白试验 22 5.2.2 样品提取溶剂选择 22 5.2.3 净化步骤的选择 23 5.2.4 固相萃取条件选择及优化 24 5.2.5 净化过程的回收率考察 25 5.2.6 其它前处理条件的选择 25 5.3 方法评价 27 5.3.1 检出限和定量限 27 5.3.2 精密度 28 5.3.3重复性 28 5.3.4 储备液稳定性 30 5.3.5 试样稳定性 30 5.3.6 试样加标回收率 31 5.3.7 比对试验结果 32 5.3.8 试样测定 33 参考文献 34 附件一 方法的检出限及定量限 36 附件二 试样中对乙氧基苯脲定性确认方法 39 1前言 1.1对乙氧基苯脲简介 对乙氧基苯脲（4-Ethoxyphenylurea）（dulcin）250倍，1884年被Joseph Berlinerbau发现。由于其与糖精钠相比没有后苦味，7年以后作为人工合成甜味剂进行大批量生产，在20世纪初占有很大的市场，作为糖尿病患者的代糖。1951年美国FDA对对乙氧基苯脲的安全性提出了质疑，1954年经过多次的动物实验证明了其能够水解成氨基苯酚而引发肿瘤，从而退出市场。对乙氧基苯脲在人体中的吸入、分布、代谢及排泄目前并无资料。经动物实验(兔与大鼠)结果显示：三小时內快速吸收进入血液，但排泄粪便中没有发现代谢物，除了脂肪之外的大部分组织中对乙氧基苯脲代谢消失都很慢。联合国粮农组织与世界卫生组织（FAO/WHO）建议每日容许摄取量：禁止使用。世界上大部分国家（美国、日本、中国台湾、中国香港）均禁止食品中使用对乙氧基苯脲。有研究表明，成人摄入20-40 g头晕恶心，低血压与发绀和高铁血红蛋白血症。在我国对乙氧基苯脲卫生标准GB2760[1]，常在蜜饯食品中检验出对乙氧基苯脲的存在。 1.2 理化性质 对乙氧基苯脲是酰胺类物质，也是脲中的一类。化学式为C9H12N2O2，CAS号为：150-69-6。对乙氧基苯脲是具有金属光泽的白色针状晶体，分子量为180.21[2]，173-174 ℃，在水中的溶解度为3.8 g/L[3]。可由对乙氧基苯胺盐酸盐和尿素加热反应制得氨基苯乙醚与二氯化碳作用后，再加入氨气而制成[4]。对乙氧基苯脲的分子结构式如下图： 对乙氧基苯脲分子结构式 1.3 检测方法综述 目前能够检索到的检测方法主要包括：薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法、毛细管电泳法、液相色谱法，下面就对乙氧基苯脲检测技术发展情况分类介绍如下。 1.3.1 薄层色谱法 Kamp.W.等[9]在1966年用薄层色谱技术分离并鉴定了对乙氧基苯脲、甜蜜素和糖精钠。1972年Ryuzo Takeshita[10]利用薄层色谱法检测食品中的甜味剂(糖精钠、甜蜜素和对乙氧基苯脲)，先用乙酸乙酯提取，硅胶和中性氧化铝柱净化，再经过聚酰胺色谱板分离，方法灵敏度范围0.01～2μg。 1.3.2分光光度法 1.3.2.1荧光分光光度法 文献报道关于对乙氧基苯脲荧光分光光度检测方法，该类方法是基于增强对乙氧基苯脲荧光强度展开的一系列工作。Uchiyama S[11]于1969年首次提出了用亚硝酸钠与对乙氧基苯脲作用，再用荧光分光光度法检测食物中的对乙氧基苯脲。Sadao Uchiyama[12]在1972年报道了用荧光分光光度法测定对乙氧基苯脲与亚硝酸钠反应得到的产物，该方法是在室温条件下，经过①对乙氧基苯脲与亚硝酸钠和盐酸发生化学反应，②混合的反应产物与氢氧化钠反应这两个步骤后，用氯仿提取、硅胶柱分离纯化，采用荧光分光光度计检测样品中的对乙氧基苯脲。 Sadao Uchiyama[13]1977年具体介绍对乙氧基苯脲与亚硝酸钠的反应