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柑橘黄龙病菌及其分子检测研究进展 　　摘要 柑橘黄龙病是世界柑橘生产人毁灭性病害。该文介绍该病的病原认识过程、病害的主要特征及病害的检测方法，包括常规PCR法、巢式PCR法、荧光实时定量PCR法、DNA杂交法、滚环介导的等温扩增（LAMP）法等。 　　关键词 柑橘黄龙病；分子生物学；检测 　　中图分类号 S436.66 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）14-0132-02 　　柑橘黄龙病作为一种严重的侵染性细菌性病害，最早在我国广东潮汕地区发现，后逐渐蔓延至四川、福建、广西、海南、江西、云南、台湾、湖南、贵州和浙江等省区，一旦发生即对植株造成毁灭性危害。近年来，柑橘黄龙病也广泛分布于东南亚、非洲南部、南美洲、北美洲等地。各个国家针对柑橘黄龙病的研究过程中曾有过多个名称，如立枯病（Likubing）、叶斑驳病（Leaf Mottle）、梢枯病（Dieback）、青果病（Greening）等。为了纪念最先通过嫁接方法证实黄龙病是一种传染性病害的林孔湘教授，于第13届世界柑橘大会决定统一用HLB（Huanglongbing）来命名柑橘黄龙病。 　　1 柑橘黄龙病原的认识过程 　　林孔湘通过嫁接的方法，发现该病能株间传播，肯定该病的病原是病毒[1]。Lafleche和Bové通过电镜观察认为是类支原体（MLO）[2]。Moll等依据黄龙病病原的包膜厚度将其归类为类细菌体（BLO）[3]，Villechamoux 等[4]发现高度保守的细菌GrplKAjL-rpoBC操纵子与亚洲黄龙病菌的某段DNA核糖体蛋白一致，从而确定黄龙病原属于真细菌。目前已经完成了黄龙病原的全基因组测序，病原全基因组的大小为1.15～1.23 Mb，其中含有噬菌体的基因组，初步确定该病害是由限制于韧皮部的难养细菌“Candidatus Liberibacter spp.”引起[5]，该病原是一种革兰氏阴性细菌，还未能进行人工培养，无法完成科赫氏法则检验，严格意义上还不能对其正式命名，该菌可能是根瘤菌的一个早期分支[6]。根据传播媒介和病原的热敏性及病原菌16S rDNA和β-操纵子基因的序列特征，将柑橘黄龙病菌分为非洲种、亚洲种、美洲种。 　　2 柑橘黄龙病害表现 　　病害初发生时，有1～2条黄梢出现在树冠中，之后黄梢数量不断增多，最后发展为整株黄化。叶片表现为均匀型或斑驳型黄化，均匀型黄化主要是新梢不转绿，斑驳型黄化主要从叶片的基部和边缘开始发黄，黄绿相间，呈现斑驳状，染病早期，叶片常显现为斑驳型黄化，待病菌散播到全树后，新梢抽生的叶片一般为均匀黄化。果实的典型症状是着色异常、果小、畸形、无光泽、味酸，难褪绿，或果蒂和果肩周围先褪绿转色，其他部位仍然为青绿色，形成“红鼻子果”或“红肩果”。感染黄龙病的柑橘种子质量减轻，多败育且萌发率降低。黄龙病后期病株，根系发生腐烂，木质部变黑皮层，易与下层组织分离。柑橘类植物感染黄龙病菌后并不立即显症，存在潜伏期。潜伏期的长短因品种、树龄、健康状况、种植环境等而异。 　　3 柑橘黄龙病的检测方法 　　田间诊断与指示植物检测、显微镜观察、生化指标鉴定、免疫学检测和基于核酸的分子生物学检测等方法均可作为柑橘黄龙病的检测方法，但前几种方法由于检测周期长或准确性及灵敏度不高，存在着局限性。基于核酸的分子生物学检测快速、准确，目前的检测方法主要集中在常规PCR法、巢式PCR法、荧光实时定量PCR法、DNA杂交法、滚环介导的等温扩增（LAMP）法等。 　　3.1 常规PCR检测 　　自1992年Villechanoux[7]开始陆续克隆、测序柑橘黄龙病病原序列以来，黄龙病的PCR检测开始得以迅猛发展。Jagoueix等设计通用引物OI1/OA1/OI2c，扩增片段长度为1 160 bp，用以检测黄龙病的亚洲种和非洲种，结果发现：非洲种被酶切为2个片段（640 bp、520 bp），亚洲种被酶切为3个片段（520 bp、506 bp、130 bp）[8]。Hocquellet等[9]设计引物A2/J5，通过PCR产物长度的不同（亚洲种700 bp，非洲种650 bp）对其进行鉴别。Teixiera等[10]根据16S rDNA的序列设计了一套引物GBl/GB3，能够检测美洲柑橘黄龙病菌，扩增子长度为1 027 bp。Subandiyah等[11]设计了大小为893 bp的OI2/23S1-rev引物扩增片段，以检测亚洲地区的黄龙病菌。丁 芳等[12]研究结果发现常规PCR技术可以检测出未显症状的黄龙病材料。 　　3.2 巢式PCR检测 　　Harakava等[13]研究结果表明巢式PCR检测相对于常规PCR检测灵敏度有所提高。丁 芳等[12]比较了常规PCR和巢式PCR技术，发现