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实验三 ELISA检测溶血素 【试剂与器材】 绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠血清 抗SRBC阳性和阴性血清 辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗甲胎蛋白抗体 碳酸盐缓冲液（PH9.6） 磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4） 邻笨二胺液 硫酸（2M） 酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。 【试剂与器材】 包被稀释液（0.05mol/L Na2CO3—NaHCO3 缓冲液，PH9.6） Na2CO3 1.5g NaHCO3 2.9g 加双蒸水至1000ml 封闭液（5%小牛血清/PBS 溶液） 小牛血清50ml PBS（PH7.4）950ml 洗涤液（PBST，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g Tween 20 0.5ml 加双蒸水至1000ml 【试剂与器材】 样本稀释液（PBS，PH7.4） NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 加双蒸水至1000ml 酶标第二抗体：羊抗人IgG 标记HRP（1：2000） 【试剂与器材】 底物液（OPD—H2O2） A 液 （0.1mol/L 柠檬酸溶液） 柠檬酸19.2g 加双蒸水至1000ml B 液 （0.2mol/L Na2HPO4 溶液） Na2HPO4.12H2O 71.7g 加双蒸水1000ml 临用前取A 液24.3ml，B 液25.7ml 终止液（2mol/LH2SO4 溶液） 双蒸水600ml，浓硫酸100ml（缓慢滴加并不断搅拌），加双蒸水至900ml 【操作方法】 （1）包被酶标反应板 用pH9.6 的碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗体，用之包被聚乙烯塑料板，每孔加0.2ml， 4°C 12~24h。 （2）封闭酶标反应板 弃掉包被液，用PBS 洗涤3 次，甩干后用5%小牛血清/PBS 液封闭。放37°C40min（或4°C 过夜）。封闭结束后用洗涤液洗板，并在滤纸上拍干，每孔洗3遍，每遍3min。 ELISA平板包被 间接法 抗原包被: 将包被液稀释的抗原（SRBC）BSA （2-10ug/ml）加入96孔酶标版中，每孔100ul，4C过夜。吸出上清液，加入封闭液200ul/孔。37C封闭1-1.5小时或4C过夜。封闭结束后用洗涤液洗板3次，每次3分钟。 【操作方法】 （3）按图1-11 所示加入待测样品及阳性对照（用PBS 稀释） 将稀释好的待测血清样品加入酶标反应板中，每孔0.2ml，阳性对照样品亦相应稀释。置于37°C 温箱0.5~1h。弃去孔中液体，用洗涤液洗涤3 遍，每遍3min。 （4）加酶标二抗 （用PBS 稀释） 加入辣根过氧化物酶标记的抗甲胎蛋抗体，每孔0.2ml 置于37°C 温箱，30~45 min。弃去孔中液体，拍干，每孔洗涤3 遍，每遍3min。 【操作方法】 （5）加入底物液 取底物液：A 液24.3ml，B 液25.7ml，加双蒸水50ml 得pH5.0 的磷酸—枸缘酸缓冲液100ml。再加入邻苯二胺40mg，充分溶解，最后加入30% H2O2 0.15ml。每孔加入底物液100μl。避光室温作用5~10min。 （6）终止反应 当阳性对照出现明显颜色变化后，每孔加入终止液50μl 终止反应。 【结果分析】 目测：根据显色深浅，用（-）为无色，（+）为浅色，（++）为黄色，（+ + +）为棕黄色表示。一般呈+ +以上者为阳性 酶标仪测定：在492nm 波长下测OD 值（A492） 。 当待测样品A492值与阴性对照A492值的比值（P/N）大于2.1时，或待测样品A492对照A492值 ￣ +3s，即可判断为阳性。以最大显色至阳性显色孔的50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。 【注意事项】 1.封闭时注意将封闭液加满各反应孔，并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。 2.加洗涤液时，每孔加满，但不要溢出。 3.每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1 分钟。 4.洗涤后板要甩干，不要残留液体。 * * x * * *