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实验三ELISA检测溶血素.ppt

实验三 ELISA检测溶血素 【试剂与器材】 绵羊红细胞(SRBC)免疫小鼠血清 抗SRBC阳性和阴性血清 辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗甲胎蛋白抗体 碳酸盐缓冲液(PH9.6) 磷酸盐缓冲液(PBS,PH7.4) 邻笨二胺液 硫酸(2M) 酶标反应板、微量加样器、温箱、冰箱、酶标仪等。 【试剂与器材】 包被稀释液(0.05mol/L Na2CO3—NaHCO3 缓冲液,PH9.6) Na2CO3 1.5g NaHCO3 2.9g 加双蒸水至1000ml 封闭液(5%小牛血清/PBS 溶液) 小牛血清50ml PBS(PH7.4)950ml 洗涤液(PBST,PH7.4) NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g Tween 20 0.5ml 加双蒸水至1000ml 【试剂与器材】 样本稀释液(PBS,PH7.4) NaCl 8.0g KH2PO4 0.2g Na2HPO4.12H2O 2.9g KCl 0.2g 加双蒸水至1000ml 酶标第二抗体:羊抗人IgG 标记HRP(1:2000) 【试剂与器材】 底物液(OPD—H2O2) A 液 (0.1mol/L 柠檬酸溶液) 柠檬酸19.2g 加双蒸水至1000ml B 液 (0.2mol/L Na2HPO4 溶液) Na2HPO4.12H2O 71.7g 加双蒸水1000ml 临用前取A 液24.3ml,B 液25.7ml 终止液(2mol/LH2SO4 溶液) 双蒸水600ml,浓硫酸100ml(缓慢滴加并不断搅拌),加双蒸水至900ml 【操作方法】 (1)包被酶标反应板 用pH9.6 的碳酸盐缓冲液1:200 稀释抗体,用之包被聚乙烯塑料板,每孔加0.2ml, 4°C 12~24h。 (2)封闭酶标反应板 弃掉包被液,用PBS 洗涤3 次,甩干后用5%小牛血清/PBS 液封闭。放37°C40min(或4°C 过夜)。封闭结束后用洗涤液洗板,并在滤纸上拍干,每孔洗3遍,每遍3min。 ELISA平板包被 间接法 抗原包被: 将包被液稀释的抗原(SRBC)BSA (2-10ug/ml)加入96孔酶标版中,每孔100ul,4C过夜。吸出上清液,加入封闭液200ul/孔。37C封闭1-1.5小时或4C过夜。封闭结束后用洗涤液洗板3次,每次3分钟。 【操作方法】 (3)按图1-11 所示加入待测样品及阳性对照(用PBS 稀释) 将稀释好的待测血清样品加入酶标反应板中,每孔0.2ml,阳性对照样品亦相应稀释。置于37°C 温箱0.5~1h。弃去孔中液体,用洗涤液洗涤3 遍,每遍3min。 (4)加酶标二抗 (用PBS 稀释) 加入辣根过氧化物酶标记的抗甲胎蛋抗体,每孔0.2ml 置于37°C 温箱,30~45 min。弃去孔中液体,拍干,每孔洗涤3 遍,每遍3min。 【操作方法】 (5)加入底物液 取底物液:A 液24.3ml,B 液25.7ml,加双蒸水50ml 得pH5.0 的磷酸—枸缘酸缓冲液100ml。再加入邻苯二胺40mg,充分溶解,最后加入30% H2O2 0.15ml。每孔加入底物液100μl。避光室温作用5~10min。 (6)终止反应 当阳性对照出现明显颜色变化后,每孔加入终止液50μl 终止反应。 【结果分析】 目测:根据显色深浅,用(-)为无色,(+)为浅色,(++)为黄色,(+ + +)为棕黄色表示。一般呈+ +以上者为阳性 酶标仪测定:在492nm 波长下测OD 值(A492) 。 当待测样品A492值与阴性对照A492值的比值(P/N)大于2.1时,或待测样品A492对照A492值  ̄ +3s,即可判断为阳性。以最大显色至阳性显色孔的50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。 【注意事项】 1.封闭时注意将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中可能产生的贴孔壁气泡。 2.加洗涤液时,每孔加满,但不要溢出。 3.每次洗涤液在孔中的停留时间不应少于1 分钟。 4.洗涤后板要甩干,不要残留液体。 * * x * * *

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