封闭及一抗问题一.封闭,一抗.ppt

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封闭及一抗问题一.封闭,一抗

Western blot 实验技术 Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。 Western实验是一项连贯的有多个步骤的实验技术,在实验过程中会遇到很多的问题,每一个环节出现问题都可能导致最后结果的失败。 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 蛋白提取 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 细胞和组织的处理 问题一. RIPA裂解液裂解细胞,离心后,还有很多粘稠物质 ? RIPA裂解细胞后的粘稠物质主要是DNA,10000rpm以上离心五分钟就可以沉淀, 取上清液。如果一次离心后还有粘稠可重复一次。 细胞和组织的处理 问题二.组织应该如何裂解最合适? 1、对于有韧性的组织比如血管,神经等,不能选用玻璃匀浆器,可以选择手动匀浆器和液氮研磨 2、对于一般较柔软的组织比如脑,肝脏等,使用上述三种方法均可。 细胞和组织的处理 问题三.液氮研磨后离心样本不能分层 研磨的时候不充分,会形成絮状的液态物质,如有手动匀浆器可以再进行处理 注意: 裂解时抑制剂的添加非常重要,做一般的蛋白加入PMSF即可,个别蛋白需要加Aprotinin, Leupeptin ,做磷酸化的蛋白需要加入磷酸酶抑制剂(cocktail) 细胞和组织的处理 问题四.提取的蛋白样本如何保存最合适? 解答:温度越低越好 1、液氮 2、-80度冰箱 3、-30度冰箱 4、加入loading buffer煮后保存于-20度。 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 SDS-PAGE电泳 (1)清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗 过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 (2)灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 2、按前面方法配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。(灌胶时开始可快一些,胶面 快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才 不会有气泡。加水液封时要慢,否则胶会被冲变型。) 3、当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固 就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 4、按前面方法配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间 灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免 胶中有气泡产生。TEMED原溶液N,N,N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。 加足够的电泳液后开始准备上样。(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次,以免交叉污染) SDS凝胶配制 问题一.胶凝的效果不好是什么原因? 1、AP时间过长,重新配制AP 2、可以适当多加入TEMED 3、室温低 4、混合不均匀 SDS凝胶配制 问题二、丙烯酰胺母液可以储存多久? 1、丙烯酰胺隔月重新配制 2、配制完分离胶要覆盖一层0.01%的SDS溶液,防止表面与空气接触。如果加一层水也可以,但由于水具有表面张力,会使胶不平。 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 电泳 电泳时间一般2~3 h,电压为根据分子量需要,电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。 电 泳 问题一.如果所做蛋白分子量很大,比如220KD,大分子的Marker跑不下去,怎么办?小分子量的蛋白如10KD左右应该注意什么? 大分子:使劲跑;小分子:谨慎跑 电 泳 问题二.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢?是有的成分不对吗? 胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了。 也可能母液(30%聚丙烯酰胺)有问题,你可以重新配制一份观察 电 泳 问题三.怎样才能把胶跑的非常漂亮,泳道和band都能很直,是不是上样的量很重要,灌胶有什么技巧吗?想跑漂亮,是不是应该先小电压,再高电压? 影响跑胶跑的质量,有以下几个因素: 1、电压,小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小,条带越漂亮,浓缩胶80v,分离胶100v就能跑得很好。 2、胶的均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀。倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水

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