封闭及一抗问题一.封闭，一抗.ppt

Western blot 实验技术 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 Western实验是一项连贯的有多个步骤的实验技术，在实验过程中会遇到很多的问题，每一个环节出现问题都可能导致最后结果的失败。 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 蛋白提取 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 细胞和组织的处理 问题一. RIPA裂解液裂解细胞，离心后，还有很多粘稠物质 ？ RIPA裂解细胞后的粘稠物质主要是DNA，10000rpm以上离心五分钟就可以沉淀， 取上清液。如果一次离心后还有粘稠可重复一次。 细胞和组织的处理 问题二.组织应该如何裂解最合适？ 1、对于有韧性的组织比如血管，神经等，不能选用玻璃匀浆器，可以选择手动匀浆器和液氮研磨 2、对于一般较柔软的组织比如脑，肝脏等，使用上述三种方法均可。 细胞和组织的处理 问题三.液氮研磨后离心样本不能分层 研磨的时候不充分，会形成絮状的液态物质，如有手动匀浆器可以再进行处理 注意： 裂解时抑制剂的添加非常重要，做一般的蛋白加入PMSF即可，个别蛋白需要加Aprotinin， Leupeptin ，做磷酸化的蛋白需要加入磷酸酶抑制剂（cocktail） 细胞和组织的处理 问题四.提取的蛋白样本如何保存最合适？ 解答：温度越低越好 1、液氮 2、-80度冰箱 3、-30度冰箱 4、加入loading buffer煮后保存于-20度。 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 SDS－PAGE电泳 （1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗 过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。 （2）灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面 快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才 不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。） 3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固 就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。 4、按前面方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间 灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免 胶中有气泡产生。TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。 加足够的电泳液后开始准备上样。（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤数次，以免交叉污染） SDS凝胶配制 问题一.胶凝的效果不好是什么原因？ 1、AP时间过长，重新配制AP 2、可以适当多加入TEMED 3、室温低 4、混合不均匀 SDS凝胶配制 问题二、丙烯酰胺母液可以储存多久？ 1、丙烯酰胺隔月重新配制 2、配制完分离胶要覆盖一层0.01%的SDS溶液，防止表面与空气接触。如果加一层水也可以，但由于水具有表面张力，会使胶不平。 实验流程 蛋白提取 SDS凝胶配制 电泳 电转 封闭及一抗 显色 电泳 电泳时间一般2～3 h，电压为根据分子量需要，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。 电 泳 问题一.如果所做蛋白分子量很大，比如220KD，大分子的Marker跑不下去，怎么办？小分子量的蛋白如10KD左右应该注意什么？ 大分子：使劲跑；小分子：谨慎跑 电 泳 问题二.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。 也可能母液（30%聚丙烯酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察 电 泳 问题三.怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上样的量很重要，灌胶有什么技巧吗？想跑漂亮，是不是应该先小电压，再高电压? 影响跑胶跑的质量，有以下几个因素： 1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。 2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水