石刁柏Ty1―copia反转座子逆转录酶序列克隆及异质性分析.docVIP

石刁柏Ty1―copia反转座子逆转录酶序列克隆及异质性分析 　　摘要：对石刁柏（Asparagus officinalis）品种UC309及TD818的两个反转座子逆转录酶序列进行了PCR扩增并对其在基因组中的异质性进行了分析。结果表明，s101366和s107518两个转座子序列均属于Ty1-copia反转座子，是Ty1-copia反转座酶的部分保守区序列，其长度分别为636和653 bp。对随机获得的两个反转座子测序表明两个反转座子存在一定的异质性，其突变主要是由于发生了碱基置换，其中碱基转换分别占到80.4%和80.0%，T？圮C和G？圮A转换的比例差异不显著。通过对两个石刁柏品种 （TD818和UC309） 中获得的序列聚类分析发现，s101366和s107518均未表现出性别间、品种间及近缘种间的保守性，甚至表现出了种内异质性大于种间的异质性特征。这说明了两个反转座子处于高度变异的状态，是产生染色体不稳定的重要因素之一。 　　关键词：石刁柏（Asparagus officinalis）；Ty1-copia反转座子；逆转录酶；序列分析；异质性 　　中图分类号：Q754 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）18-4819-05 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.048 　　显花植物中，包括6个双子叶和5个单子叶亚纲在内的75%的科，都存在雌雄单性或者雌雄异株种[1，2]，大约38%（167个）的科和7.1%（959个）的属中有6%（14 620种）的植物是雌雄异株植物[2]，如石刁柏（Asparagus officianalis）、啤酒花（Humulus lupulus）、番木瓜（Carica papaya）、菠菜（Spinacia oleracea）等[3]。研究表明，雌雄异株植物的性别决定方式多种多样，其中性染色体决定是最为常见的性别决定方式之一[2]。截至2011年，在陆生开花植物中已经发现有15个科21个属40种植物具有同型或者异型性染色体（多为XY或者ZW系统），这些性染色体（XY或ZW）最初起源于一对常染色体[3，4]。但是对于早期性染色体如何从常染色体逐步演化为异型或者同型性染色体的机制仍不清楚。 　　反转座子是一类广泛存在于真核细胞中可移动的DNA元件，具有高拷贝数、高异质性和插入位点专一性等特点[5]，又称反转录转座子、逆元件。研究表明，反转座子在植物的基因组中广泛存在且占有较大的比例，如拟南芥和水稻基因组中反转座子分别占了基因组的10%[6]和22%[7]，小麦基因组中反转座子成分甚至达到49.07%[8]。Ty1-copia类反转座子是广泛存在于高等植物基因组中的一类反式元件[9]，且能够通过整合过程中的重组和染色体重排来影响基因组和染色体组的稳定[10，11]。因此，Ty1-copia类反转座子的这种诱发染色体组的不稳定作用可能是导致性染色体起源的因素之一[12]。研究表明，番木瓜Yh染色体雄性特异区的转座子主要为Ty1-copia和Ty3-gypsy，且X染色体上的Ty3-gypsy反转座子是常染色体上的两倍[13]，进一步暗示了Ty1-copia类反转座子在植物性染色体演化中可能具有重要的作用。 　　石刁柏是一种较为严格的雌雄异株植物，体细胞染色体数为2n=20，具有一对同型的性染色体[14]。研究发现石刁柏染色体组存在异型的常染色体对、B染色体数目不固定等特征[15，16]，说明石刁柏的染色体组处于不稳定的状态，但是尚未有报道证明这种不稳定状态产生的原因。因此，本研究在利用高通量测序技术对石刁柏基因组重复序列测序的基础上分析了两个Ty1-copia类反转座子的序列特征，并对其异质性进行了研究，为进一步分析反转座子和石刁柏染色体组的稳定性直接关系及了解性染色体进化早期阶段的相关信息提供参考依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料 石刁柏（品种UC309和TD818） 种植于河南师范大学生物实验园地。采用无激素、化肥栽培方式管理，通过花的结构鉴定性别。石刁柏同属雌雄同株植物文竹（Asparagus setaceus）购自于河南省新乡市农贸花卉市场。 　　1.1.2 载体与引物 克隆载体为pMD？?R19-T，购自于宝生物工程（大连）有限公司。所用两个反转座子序列引物根据新乡医学院石刁柏基因组高通量测序结果[17]设计，反转座子s101366上游引物序列为5′-GCAATCGTGTTGGTCTAAGT-3′，下游引物序列为5′-CGCCTCTGTAGTTGATAATG-3′，预期长度为635 bp。s107518上游引物序列为5′-TCATTATC- GCTCTG