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绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠免疫功能的影响 　　摘要：采用HPLC对发酵前后的绞股蓝皂苷（Gvpenoside）进行了分析，选用75只健康小鼠，随机分为阳性对照组、阴性对照组、低剂量试验组、中剂量试验组、高剂量试验组共5个处理组，每组5只小鼠，3个重复。阴性对照组每日灌服0.5mL生理盐水，阳性对照组每日灌服0.5mL未发酵的绞股蓝皂苷溶液，3个试验组分别每日灌服发酵的绞股蓝皂苷溶液0.2、0.5、0.8mL，连续灌服10d。结果表明，HPLC分析显示，经枯草芽孢杆菌发酵后的绞股蓝皂苷成分发生了明显变化，且与对照组相比，经过发酵的绞股蓝皂苷能够显著提高小鼠的脾脏指数和胸腺指数（P0.05），同时还能显著提高小鼠血清中IgG和IgA的含量（P0.05），对小鼠血清中IL-2的产生也有一定的促进作用。说明枯草芽孢杆菌对绞股蓝皂苷具有一定的生物转化作用，且经微生物转化后的绞股蓝皂苷具有促进小鼠免疫器官发育和增强体液免疫的功效。 　　关键词：绞股蓝皂苷；枯草芽孢杆菌；发酵；小鼠；免疫功能 　　中图分类号：R285.5；R593 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2304-04 　　绞股蓝[Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Makion]为葫芦科（Cucurbitaceae）绞股蓝属（Gyuos-temma）植物，在动物医学上具有抗肿瘤、增强免疫、镇静止痛等作用。药理学研究表明，绞股蓝含有多种化学成分，其中以绞股蓝皂苷为主要的药理活性物质。近年来。随着中药制剂研究的不断深入。国内开展了利用微生物发酵技术对中草药有效成分进行生物转化作用的研究，但是目前国内关于绞股蓝皂苷微生物转化作用的研究尚不多见，如陈良华等的研究表明，黑曲霉可对绞股蓝皂苷进行生物转化。且转化后的成分具有抗癌活性：朴香兰等的研究证明，经保加利亚乳杆菌发酵转化后的绞股蓝皂苷较转化前具有更强的抗癌活性。但是，上述研究均未表明绞股蓝皂苷经微生物转化后，其转化成分是否还具有诸如增强免疫器官指数和体液免疫水平等其他的生物学特性。因此，本研究将以绞股蓝皂苷为底物，利用微生物对其进行发酵，并检测发酵后的绞股蓝皂苷对小鼠的各项免疫功能具有何种作用，从而为微生物发酵绞股蓝在畜牧业上的应用提供参考依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　绞股蓝原药购自河南顺康医药有限责任公司：发酵用菌种为河南牧业经济学院微生物实验室保存的枯草芽孢杆菌， 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 绞股蓝皂苷的提取与发酵 用粉碎机将适量的绞股蓝粉碎，以25倍量（m/v）的75%乙醇溶液80℃提取2h，将提取液过滤并减压浓缩成浸膏状，将浸膏用适量蒸馏水悬浮，在梨形分液漏斗中用正丁醇萃取3次，萃取液减压浓缩后再经旋转蒸发后得到干燥的绞股蓝皂苷发酵底物。将绞股蓝皂苷发酵底物按3%比例加入液体转化培养基（葡萄糖1.0g，KH2PO41.0g，蛋白胨5.0g，MgSO4?7H2O0.5g，蒸馏水1000mL），经高压蒸汽灭菌后备用。将枯草芽孢杆菌按5%接种到上述培养基，于37℃静置培养4d。 　　1.2.2 绞股蓝皂苷发酵产物的HPLC检测 发酵结束后，将发酵液10000r/min离心5min，取上清液用等体积的饱和正丁醇萃取3次，所得有机溶剂在45℃减压浓缩得残留物，将残留物中加入2mL甲醇，用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。分别将绞股蓝皂苷发酵后的提取物与未发酵的绞股蓝皂苷进行HPLC分析。HPLC的分析条件为，色谱柱：PhenomexC18柱（250min×4.6min×5μm）；柱温30℃；检测波长203nm；进样量20μL；流速1.0mL/min；流动相为水（A）/乙腈（B）梯度洗脱：洗脱程序如表1所示。 　　1.2.3 绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠免疫器官指数的影响75只体重20g左右的健康小鼠，平均随机分为5组，每组5只小鼠，3个重复。分别为阴性对照组、阳性对照组、低剂量试验组、中剂量试验组、高剂量试验组，其中阴性对照组每只小鼠每日灌服0.5mL生理盐水，阳性对照组每只小鼠每日灌服未经发酵的绞股蓝皂苷溶液f绞股蓝皂苷：水：1：1，V：V）0.5mL。低剂量、中剂量和高剂量试验组每只小鼠每日灌服经过发酵的绞股蓝皂苷溶液0.2、0.5、0.8mL，各组小鼠连续灌服10d，常规饲养管理。试验期结束后24h，将各组小鼠摘眼球采血处死。利用精密电子天平称量体重后，分别摘取脾脏和胸腺并称重，计算脾脏指数（脾脏重/体重）和胸腺指数（胸腺重/体重）。 　　1.2.4 绞股蓝皂苷发酵产物对小鼠体液免疫因子的影响 上述各组小鼠摘眼球采血后，将血液离心获得血清，分别测定各组小鼠血清中的IgG、IgA、IL-2含量，具体方法按照各相应的ELISA