羽绒中DNA提取方法及鸭绒鹅绒成分的定量检测.docVIP

羽绒中DNA提取方法及鸭绒鹅绒成分的定量检测 　　摘要：为提高用PCR法鉴定鸭绒鹅绒的准确度，提高羽绒中DNA的提取效率，优化了DNA提取方法；同时为了便于对羽绒制品的真伪鉴别，建立了羽绒中鹅绒鸭绒等的定量计算方法。通过比较5种前处理方法和4种抽提试剂盒及其组合间的抽提效率，建立最佳的抽提程序。利用荧光PCR定量的优势，建立了羽绒中的鹅绒鸭绒比例定量计算的方法，并将计算得到的值与预设的混合比例加以比较。经验证，本研究建立的鹅绒鸭绒等定量计算方法能准确反映含量变化的趋势，可作为一种有效的辅助手段对羽绒制品进行真伪甄别。 　　关键词：羽绒；DAN提取；荧光PCR；定量检测；真伪甄别 　　我国是世界上最大的羽绒及制品的生产国和出口国，也是最大的消费国[1]。目前市场上羽绒产品主要是鹅绒、鸭绒两大类，两种绒在外观上并无明显区别，但在保暖性能上，相同含量的鹅绒要优于鸭绒，鹅绒的价格要高于鸭绒[2]。因此出现了将鸭绒或其他陆禽的毛绒掺在鹅毛绒中进行销售，以牟取暴利的现象。鸭、鹅毛绒的鉴别是羽毛绒检测中重要一项，相关标准，如GB/T 10288―2003《羽绒羽毛检验方法》，FZ/T 80001―2002《水洗羽毛羽绒试验》等为鹅、鸭毛绒的种类鉴定提供依据。但在日常检测中，一方面，相关标准基本上都是一些文字性说明，检验人员难以准确掌握；另一方面，鸭、鹅毛绒以各种形式存在，羽毛分为正常和损伤两种，羽绒主要指绒子和绒丝，绒子还分为朵绒、未成熟绒、类似绒和损伤绒等，微观显微结构存在交叉、雷同现象，给检验造成了困难[3]。 　　陈国培等[4]设计了鸭和鹅物种特异性的引物探针，并通过建立荧光PCR的方法对鸭绒和鹅绒进行鉴定，该方法克服了显微镜观察法主观性大的缺点，可作为显微镜法有效的辅助检测手段。以DNA为目标检测物的PCR方法，其前期DNA的提取质量直接关系到整个检测过程的成败。该文献报道使用SDS-异硫氰酸胍-β-巯基乙醇的提取方法能满足检测的需求，但该方法比较耗时费力，整个提取步骤仅水浴就耗时6个小时，而DNA还需要沉淀过夜进行收集。除此以外，关于从羽绒制品中提取DNA的方法则鲜有报道。为提高用PCR法鉴定鸭绒鹅绒的准确度，我们尝试了不同前处理方法和不同抽提试剂盒，以提高鸭绒、鹅绒提取DNA的效率。在此基础上，我们利用荧光PCR可定量的特性，建立了羽绒制品中鹅绒、鸭绒等比例的计算方法。 　　1 材料和方法 　　1.1 羽绒 　　羽绒样品来自浙江中大技术进出口集团有限公司和浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心微生物实验室。在各种前处理和DNA提取方法的比较试验中，选用了“北京白鸭绒”“波兰白鸭绒”和“东北白鹅绒”3个样品；在后续的羽绒样品DNA提取和物种成分检测试验中所用的样品见表1。 　　1.2 DNA抽提 　　（1）DNA抽提前的处理 　　在用试剂盒抽提DNA前，先用剪刀将羽绒尽可能地剪碎剪小，然后再进行以下前处理：前处理A――不再做任何前处理，直接按照试剂盒步骤进行DNA抽提；前处理B――振荡研磨法：将剪碎的羽绒放入带有磁珠（Φ3mm，Sigma，美国）的管子中，用振荡研磨仪进行研磨（5500 r/min 振荡20s，重复4～6次）；前处理C――手工液氮研磨法：将剪碎的羽绒放入研钵，加入液氮，手工研磨至细末；前处理D――振荡研磨法+手工液氮研磨法：即经过振荡研磨处理后的样品，再用液氮研磨处理；前处理E――机器液氮研磨法：使用冷冻研磨仪进行研磨，研磨程序设置为：研磨循环数为1，预冷时间7min，研磨时间2min，研磨间隔时间2min，运行频率12次/min。 　　经过上述前处理的样本各取50 mg，用DNA抽提试剂盒K1按照说明书进行抽提，最后将抽提得到的DNA溶解在50μL水中。重复3次。 　　将上述抽提得到的DNA，进行浓度、纯度检测，同时进行荧光PCR检测。 　　（2）DNA抽提试剂盒 　　通过DNA浓度、纯度比较和荧光PCR检测结果比较，在A、B、C、D、E中选择一种较理想的方法，作为统一的前处理的方法，在此前基础上，再比较不同DNA抽提试剂盒的提取效果。各种试剂盒如下：K1试剂盒：Promega（美国）FF3750抽提试剂盒，该方法是磁珠吸附法，整个过程耗时1.5h～2h，取样量为50 mg，最后抽提得到DNA溶解在50 μL水中。K2试剂盒：Promega（美国）DC6740抽提试剂盒，该方法是磁珠吸附法，整个过程耗时不超过2h，取样量为50 mg，最后抽提得到DNA溶解在50 μL水中。K3试剂盒：QIAamp（美国）56304抽提试剂盒，一管取样10 mg（试剂盒要求一次取样量不超过10 mg），共抽提5管（5个样），最后5个管抽提得到DNA都用同一50 μL水重复洗脱，作为一个样品。K4试