第四节细菌和链霉菌的分子克隆载体.ppt

* * 第四节 细菌和链霉菌的分子克隆载体 一、革兰氏阴性菌克隆载体 1. 移动载体（mobilizable vector） 1)?特点 i. 广谱宿主范围，即复制子和遗传标记具很宽适应范围 ii. DNA的转移常常需要经过中间宿主细胞和借助于辅助质粒，DNA进入中间宿主细胞可用直接转化 2)?结构 i. RK2质粒的结构 a. oriV DNA复制起点 b. DNA复制基因 c. DNA转移基因 d. oriT DNA转移基因 e. 药物抗性基因（Apr Kanr Tcr） G+菌的质粒和载体 ⅱ. 移动载体与辅助质粒 pRK2013: 将RK2中的全部转移基因和Kanr基因插入到 E.coli的colE1质粒中构成辅助质粒 pRK290: 余下部分（Apr除外）构成移动载体（约20Kb） * 当选用E.coli为中间宿主时，必须先将pRK290经过直接转化引入E.coli（pRK2013也应转入同一细胞）。当要转移pRK290时，只需将E.coli细胞与其他G‐细胞混合，在pRK2013的作用下，pRK290可接合转移至终宿主细胞。 3)??不相容群（incompatibilitiy group）克隆载体 ⅰ. P群：RP4 RK2 RP1 R68 2-5拷贝 ⅱ. Q群：R300B RSF1010 R1162 15-20拷贝 ⅲ. W群：Sa 2-5拷贝 4）遗传标记基因 大多数为抗生素标记基因，要注意不同G‐菌中的表达活性 G-细菌中重组质粒的转移 2. 非移动载体(non-mobilizable vector) 1) 特点：不能接合转移，但可经过直接转化进入那些可形成感受态的细菌，具有广谱和窄谱两大类载体 2) 实例： P4D0105-由E.coli噬菌体P4构建而成，适合于E.coli和肺炎克蕾伯氏菌。 ⅰ. 当辅助噬菌体提供P4整合酶时，该载体可整合到E.coli染色体中，整合入肺炎克蕾伯氏菌染色体则与整合酶无关。 ⅱ. 该载体含有一个virl突变和在引物酶基因α中存在一个琥珀突变(am52)，在无抑制子突变的菌株中，该载体不能自主复制，但在有抑制子突变的菌株中(琥珀抑制子突变体），该载体则可自主复制。 P4D0105载体的结构 二、革兰氏阳性菌（G+）克隆载体 1.枯草杆菌克隆载体 1）B.subtilis作为宿主菌的优点 ⅰ. 芽孢形成过程可用于阐明细胞发育过程 ⅱ. 遗传背景较清楚，可直接导入外源DNA ⅲ. 非致病细菌，因而安全 ⅳ. 研究结果可用于其它芽孢杆菌 ⅴ. 存在各种分泌蛋白质 2）B.subtilis作为宿主菌的缺点 ⅰ. 存在多种蛋白酶基因和相应产物 ⅱ. 外源DNA导入细胞后不稳定，易发生重组反应 3)克隆载体 ⅰ.复制子来源 i) 质粒DNA 质粒名称 大小(kb) 标记基因 拷贝数 来 源 pUB 4.5 Kanr 50 金黄色葡萄球菌 pE194 3.7 Eryr 10 同上 pC194 2.9 Cmlr 同上 pSA0501 4.1 Strr 20-50 同上 pBC61