子学习情境3干扰素发酵基因工程菌的发酵生产水平，不但和菌种的.docVIP

子学习情境3 干扰素发酵 基因工程菌的发酵生产水平，不但和菌种的遗传特性有关，而且和发酵工艺控制有密切关系。基因工程药物实现工业化生产需要解决两个关键问题，一是如何构建基因工程菌使其含有外源药物基因，并且能够有效合成目标蛋白；另一个是如何实现基因工程菌的发酵工艺控制，实现目标产物的高效表达。 基因工程菌株Pseudomonas putida VG84[pVG3]工程菌株应该具备假单胞杆菌 宿主细胞的特征和生产于扰素的能力。基因工程菌的特性如下： 1、宿主细胞假单胞杆菌特性 (1)细胞形态。革兰阴性，可运动，有荚膜，无芽抱，杆状，长度为3～5μm。 (2)菌落特征。在LB琼脂培养基上，30℃培养24h，其菌落直径为2.5～3.Omm， 灰绿色半透明状。菌落之间结构相同，具有黏稠性。 2、生化特性 不能将明胶、淀粉、聚-β-羟丁酸液化为可溶性单糖，不能利用反硝化作用进行厌氧呼吸，能够合成荧光色素。菌株为苏氨酸营养缺陷型，可以利用L-缬氨酸、DL-精氨酸和L-苏氨酸作为碳源。 3、遗传特性 DNA中G和C的含量为63%。细胞中携带pVG3质粒，具有硫酸链霉素、盐酸四环素和氨卡青霉素的抗性。 4、生产能力 具有生产干扰素- a 2b的能力，其放射性免疫学效价不低于2.O×lO9IU/L。 任务1 菌种库和工作菌种库的建立及保存 1、菌种库的建立、传代及保存 从原始菌种库出发，传代、扩增后，冻干保存，作为主代菌种库(Master cell bank,MCB)，主代菌种库不得进行选育工作。从主代菌种库传代、扩增后，甘油管保存，作为工作菌种库(Working cell bank,WCB)。工作种子库也可由上一代工作种子库传出，但每次只限传三代。每批主代菌种库均进行划线LB琼脂平板、涂片革兰氏染色、对抗生素的抗性、电镜检查、生化反应、干扰素的表达量、表达的干扰素型别、质粒检查的检定，合格后方可投产。 原始菌种库、主菌种库和工作菌种库于-70它以下温度保存。 2、工作菌种库的建立及保存 (1)培养基制备。生产过程中使用的培养基均按一定工艺要求配制。 (2)接种、转移及培养。取12支主代菌种库菌种接大摇瓶内，摇床培养，至 吸光值(OD值)为5.5±1.0。将己培养好的摇瓶种子液转移至种子罐中，通人无菌空气，培养至吸光值符合放罐要求(OD值为8.0±2.0)。种子罐培养结束后，无菌操作转移到离心管中，离心l5mmn，加新鲜菌种培养基，将菌体制成菌悬液，并加入甘油使其浓度达到18%，分装于Ependorf管中，每支(1.0±0.2)mL。 (3)保存。分装完毕，于-2O℃放置16～20h，在-70℃下可保存3年。 任务2 干扰素发酵工艺过程控制 一、干扰素发酵工艺过程 菌种制备 取-7O℃下保存的甘油管菌种 (工作种子批)，于室温下融 化。然后，接人摇瓶，培养温度30℃，pH值7.0，250r/min活化培养 (18士2) h后。进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。 (2)种子罐培养 将己活化的菌种接入装有 30L培养基的种子罐中，接种量 为 10%，培养温度 30℃，pH值7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养3～4h，当OD值达到4.0以上时，转人到发酵罐中，进行二级放大培养，同时取样进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂茵。 （3)发酵罐培养。将种子液通入 300L培养基的发酵罐中，接种量 10%，培养温度30℃，pH值7.0。级联调节通气量和搅拌转速。控制溶解氧为 30%，培养4h。然后控制培养温度20℃，pH值6.0，溶解氧为 60%，继续培养 5～6.5h。同时进行发酵液杂菌检查。当OD值达9.0士1.0后，用 5℃冷却水快速降温至15℃以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转人收集罐中，加人冰块使温度迅速降至10℃以下。 (4)菌体收集。将己降温至2O℃ 以下的发酵液转人连续流离心机，1600Or/ min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于-20℃冰柜中保存时。不得超过12个月。每保存 3个月，检查一次活性。整个发酵工艺过程如图4-1所示。 图3-1干扰素- a 2b发酵工艺流程图 二、干扰素发酵工艺过程控制 (1)发酵中菌体生长与干扰素合成的关系 在假单胞杆菌的发酵生产中，菌体 在培养1.5h分裂速度最快，到3.5h开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5h之后，在4h达到最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单胞杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态。 (2)培养基组成。一般地，种子培养基的营养成分宜丰富些，尤其是氮源的 含量应较高(即C/N低)。相反，对于发酵培养基，氮源含量应比种子培养基稍低 (即C/N高)。假单胞