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鸡EX-FABP基因遗传变异及与肌内脂肪含量的相关分析 组员：林俊全 刘嘉杰 刘晓佳 卢祖强 吕福琨 丘淑玲 区永龙 宋春青 研究内容 研究的意义和目的 研究对象 实验方法 实验结果分析 讨论得出结论 一、研究的意义和目的 现如今，中国经济持续发展，人民生活水平不断提高，人们开始对鸡肌肉品质和产肉性能提出更高的要求。众所周知,IMF是影响鸡肌肉品质的一个重要指标,而鸡的EX-FABP基因在甘油三酯的合成、脂肪酸的转运和脂肪的代谢起着很重要的作用。因此，通过实验研究EX-FABP基因上的2773 TC,2867 CT和2913 GA三个位点2773T C, 2867 C T和 2913 G A三个位点在贵妃鸡中表现为单态，在怀乡鸡和杂交F1群体中表现为多态，这3个位点有望作为贵妃鸡、怀乡鸡乃致其他品种鸡种质资源鉴定的参考依据。 作为特禽品种，贵妃鸡具华丽的外观，皮薄，脂少，骨细，肉实，属瘦肉型珍禽；怀乡鸡是广东省著名的地方品种，肉味鲜美。鉴于二者在产肉性能上的差异，故本实验利用PCR-SSCP和测序方法研究了贵妃鸡、怀乡鸡以及二者的杂交F1代群体EX-FABP基因遗传特征及差异，分析影响胸肌肌肉品质的分子遗传标记，为优质鸡育种以及我国地方鸡种种质资源保护和利用提供分子生物学依据。 二、实验流程 研究对象 怀乡鸡：怀乡鸡原产自广东省茂名市所属的信 宜市怀乡镇，另在1983年前信宜属湛江管辖，故怀乡鸡 又被称为信宜鸡、湛江鸡。怀乡鸡为肉用鸡种，肌肉丰 满、肉质嫩滑，具三黄鸡（黄羽、黄皮、黄爪）特征， 1985年被列入《广东省家畜家禽品种志》，正式成为广 东省名牌鸡品种。（图1） 图1 贵妃鸡：贵妃鸡又名贵妇鸡，原产英国皇室， 其头戴凤冠，身披黑白花羽，天生丽质，被英国皇室定 名为“贵妃鸡”，专供宫廷玩赏和御用，并禁止民间饲 养。其集观赏、美食、滋补于一身，野味浓，营养丰富， 其肉质细嫩，油而不腻，美味可口，富含人体所需的17 种氨基酸，10多种微量元素和多种维生素，特别是被称 为抗癌之王的硒和锌的含量是普通禽类的3—5倍，是当 代最为理想的食疗珍禽，被誉为“益智肉”、“美容肉”、 “益寿肉”。（图2） 图2 怀乡鸡公鸡与贵妃鸡母鸡杂交F1代 返回 鸡胸肌样品的制备 本实验以怀乡鸡、贵妃鸡以及怀乡鸡公鸡与贵妃鸡母鸡杂交F1代360只鸡为研究对象，每个群体120只（公母各半）。在16周龄末360只鸡翅静脉采血，ACD抗凝后，常规酚氯仿抽法提取鸡基因组DNA，保存备用。同时，每个群体随机选取60只（公母各半）屠宰，取得胸肌样品，然后利用索氏抽提法测定IMF。(IMF：肌内脂肪含量) 返回 酚氯仿法提取鸡基因组DNA 实验原理:先从全血中分离白细胞，再通过蛋白酶K消化，通过酚、氯仿的抽提,使DNA进入水相与蛋白质成分分开，在RNase(核糖核酸酶,是一类催化RNA降解为小片段的核酸酶)作用下，降RNA以纯化DNA。 酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚,而DNA不溶于乙醇等有机溶剂晶因此可以通过乙醇沉淀来纯化和浓缩DNA。 返回 索氏抽提法--测定IMF 实验原理：采用索氏抽提法中的残余法，即用低沸点有机溶剂（乙醚或石油醚）回流抽提,除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之差，计算粗脂肪含量。由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外，还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质，因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。 实验方法：将胸肌样品置65℃烘箱中先烘24h后研碎，过 四十目筛(去除肌腱等杂质)；将脱脂滤纸在105℃烘箱 中烘4h至绝干后称重；取1克左右过筛后的样品包入滤 纸中，在烘箱中105℃烘干后称出脱脂前滤纸包的准确 重量；然后放入索氏抽提器中用乙醚抽提48h，水浴温 度62～65℃；脱脂后的样品包烘至绝干后称重。? 公式：样品（绝干）脂肪含量（％）=100×（脱脂前样 包重-脱脂后样包重）/（脱脂前样包重-绝干滤纸重） 返回 根据鸡 EX-FABP基因序列,设计编码区及相邻区引物。PCR 反应条件: 95 ℃，5 min； 94 ℃，45 s，退火 40 s，延伸 40 s，循环 35次；72 ℃延伸 6 min。 引物具体见表1 引物设计与目的片段扩增 返回 返回 PCR-SSCP与测序法分析差异SNP位点 2. PCR-SSCP方法 单链构象多态性分析（single-strand