3.4_NA_Hyb_seqN2概要.ppt

1. 方法 1) 酶法:双脱氧核苷酸链终止法(dideoxy-termination sequencing) 原理:双脱氧(2‘,3’)-核苷酸可以象2‘-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中,但因3’ 端不具OH基,DNA链合成至此中断. 由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同, 故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列. 一. DNA的核苷酸序列分析 * 过程：制备ssDNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。` 该法亦适合mRNA的序列分析。 GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。 * 原理: DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应,然后发生碱基脱落或取代，最后发生链断裂,不同位置断裂的DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列. 2) 化学法 * * i. 嘌呤(A和G)序列测定 硫酸二甲酯处理DNA链时,G的7位和A的3位氮原子被甲基化,甲基化后的嘌呤环可被哌啶取代,从而导致链断裂.由于G比A 更易甲基化(5倍),且mG比mA更不稳定,因而易发生链断裂. 控制好反应温度与时间,只使G反应而A不反应,从而可测出G序列. 若用甲酯代替硫酸二甲酯,A与G均会发生反应.比较两反应系统电泳结果,就可知道A的序列. ii. 嘧啶（C和T）序列的测定 用肼处理ss-DNA时,可使嘧啶开环,被哌啶取代后而导致磷酸二酯键断裂.若反应在高盐浓度下进行,T与肼的反应受抑制,因而可测得C的序列,比较加盐与不加盐反应的结果,就可测定T的序列。 (该法的优点是不需要模板,引物和DNA聚合酶.待测DNA链的检测用32p末端标记) 化学测序结果示意图 * 酶法测序(Sanger) 化学测序法(Maxam-Gilbert) 待测DNA片段 待测DNA片段 ↓ ↓ 次克隆 5’-末端标记 ↓ 筛选重组子 链分离 限制酶切 ↓ 模板增殖与纯化 ↓ ↓ 纯化标记的ss-DNA 与引物退火 ↓ ↓ 定序反应 定序反应 ↓ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 真空干燥