人教版选修一专题五课题三血红蛋白的提取和分离(共33张PPT)讲述.ppt

(4)透 析： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 ②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 该结果说明什么？ 原理：透析袋（半透膜）能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。 透析法 （二）凝胶色谱操作 1、 凝胶色谱柱的制作 打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管 2、凝胶色谱柱的装填 固定色谱柱→配凝胶悬液→装填色谱柱→洗涤平衡 3、样品的加入和洗脱 调节缓冲液面→滴加透析样品→样品渗入凝胶床→洗脱→收集分装蛋白质 2.凝胶色谱操作: （1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 2、凝胶色谱柱的装填 固定色谱柱－配凝胶悬液－装填色谱柱－洗涤平衡 磷酸缓冲液 沸水浴加热 紧密 (pH为7.0) 不得有气泡 （二）凝胶色谱操作 （2）凝胶色谱柱的装填 ①凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶,浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ③凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 1、含量：占细胞干重的50％以上，是细胞中含量最多的有机化合物。 2、组成元素：C、H、O、N 3、基本单位：氨基酸 蛋白质小知识 氨基 NH2 COOH 羧基 H R —C— 4、分子结构： 氨基酸 多肽 蛋白质 肽键：—CO—NH— 5、相对分子质量：高分子化合物 蛋白质小知识 脱水缩合 盘曲折叠 1、分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 2、蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 思考 凝胶色谱法（分配色谱法） 1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 性质：微小的多孔球体 本质：多糖类化合物 实例：葡聚糖、琼脂糖 凝胶色谱法分离蛋白质 凝胶色谱法（分配色谱法） 2、原理： 当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。 相对 分子质量 大 小 直径大小 大于凝胶颗粒孔道直径 小于凝胶颗粒孔道直径 运动路径 被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过 因扩散进入凝胶颗粒内部而被滞留 运动速度 较快 较慢 运动路程 较短 较长 洗脱次序 先 后 缓冲溶液 1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。 2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。 3、配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。 还记得人体血液中的缓冲液吗？ H2CO3 /NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4 你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？目的是什么？ 本实验使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。 电泳 1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2、原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可