基因工程4课件.ppt

第三章 基因克隆载体 3.1质粒载体 　 质粒，就是独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸分子。 质粒的存在形式 质粒的分类 构建质粒克隆载体的原则 (1)选用合适的出发质粒； (2)获得构建质拉克隆栽体的元件； (3)组装合适的选择标记基因； (4)选用合适的启动子； (5)提高外源DNA的容量； (6)需要灭活出发质粒上的某些编码基因； (7)在能达到预期目的的前提下构建质粒克隆载体的过程应力求简单； 质粒改造方法 不同类型质粒载体的选择 质粒载体的类型 ⑴ 高拷贝数的质粒载体 　　 在没有蛋白质合成的条件下仍能复制，具有低分子量、高拷贝数的特点。在基因工程中用于分离大量的高纯度的克隆基因DNA片段。通常选用Col1、Pmb1或它们的派生质粒。 　 ⑵ 低拷贝数的质粒载体 　分子量相对高，拷贝数低。某些克隆的编码基因的产物过量而影响寄主细胞的正常代谢，在克隆这样的基因时需要用低拷贝数的质粒作为载体，使其表达水平置于严格控制之下。 ⑶ 失控的质粒载体 　有些质粒载体具有温度敏感复制控制特点，在不同的温度条件下其拷贝数有显著的变化。即低拷贝数的质粒在某些温度下其复制失去了控制而表现高拷贝数质粒的特点，虽然这会导致细胞的生长受到抑制，但此时质粒DNA的产量得到明显的提高。 ⑷ 插入失活的质粒载体 　大部分情况下要克隆的外源DNA片段都没有选择性标记，此时用我们以前讲过的标记基因内有限制位点的质粒载体来克隆这些外源DNA片段，使质粒的某一选择性标记失活而选择带有外源DNA片段的转化子。也可用对载体酶切末端进行修饰等方法达到同样的目的。 ⑸ 正选择质粒载体 　 应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件下进行选择，这样我们在转化之后直接就能选择出重组质粒。 举例：正选择质粒载体pKN80 Pkn80编码一种对Mu噬菌体非溶源性菌株具有致死效应的kil基因，在pKN80质粒的HpaI或HindIII位点插入外源DNA，便会使这种致死效 应失活，产生出具 有Ampr表型的Mu 噬菌体非溶源性的 转化子菌株。这样， 我们就直接选择出 在HpaI或HindIII位 点插入外源DNA的 重组体质粒转化 子。 典型的大肠杆菌表达载体 ⑹ 表达性的质粒载体 　　 将克隆外源真核基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下，这种特殊设计构建，能使克隆在其特定位点上的外源真核基因的编码序列在大肠杆菌细胞中正常转录并翻译成相应蛋白质的克隆载体称为表达载体。 pSC101质粒载体 　 pSC101是一种严紧型复制控制的低拷贝数的大肠杆菌质粒载体。 　该质粒具有EcoRI等7中限制性内切酶的单一切割位点，其中HindIII、BamHI和SalI等3个位点克隆外源DNA时，都会导致tetr基因的失活。 pSC101应用实例1： 金黄色葡萄球菌的Ampr 基因插入pSC101质粒 pSC101应用实例2： 应用pSC101质粒作载体在大肠杆菌细胞中克隆非洲爪蟾的rDNA基因片段。 ColE1质粒载体 　 ColE1 质粒载体也属于天然质粒，是大肠杆菌Col类质粒的一种，能产生大肠杆细菌素。 ColE1 质粒大小为6．3kb。　　 在含有ColE1 质粒的大肠杆菌培养物中加入适量的氯霉素以抑制蛋白质的合成，宿主染色体DNA的复制使被抑制，细胞的生长也随之停止，而质粒DNA仍可继续进行数小时的复制。 pBR322质粒 　 pBR322 质粒由3个不同来源的部分组成：氨苄青霉素抗性基因（ampr）；四环素抗性基因（tetr）；DNA复制起点。 pBR322 质粒的优点： 1. 分子量较小：4363bp，易于自身DNA的纯化，可克隆达6kb的外源DNA。 2. 具有两种抗生素抗性基因（ampr和tetr）可供作转化子的选择性标记。 3. 具有合适的限制性内切酶切割位点。 4. 具有高拷贝数。 pBR322 质粒载体tetr基因的插入失活 pUC 质粒载体 　 pUC质粒载体是在pBR322的基础上，发展起来的，具有双功能检测特性的新型质粒载体系列。 ⑴ pUC质粒载体的结构：有以下4个组成部分 ① 来自pBR322的复制起点； ② 无限制位点的氨苄青霉素抗性基因（ ampr）； ③ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ′基因； ④ 位于lacZ′基因中的靠近5′-端的一段