基因工程5课件.ppt

第四章 DNA分子克隆 4.1基因克隆方案 ①含目的基因的DNA片段的获得 ②载体与目的DNA片段的体外重组 ③重组DNA分子转入宿主细胞 ④重组分子的筛选 4.2 重组体构建 ①直接连接具有黏性末端的ＤＮＡ片段； ②直接连接平齐末端的ＤＮＡ分子，或用末端转移酶给平齐末端片段先加尾，然后再连接； ③给ＤＮＡ末端加衔接物或接头，再连接。 黏末端连接 黏末端定向连接 ①调整连接反应体系中两种ＤＮＡ的浓度以及比值 ； ②用碱性磷酸酶(小牛肠碱性磷酸酶)，对线性的载体 进行去磷酸化处理 ； ③双酶切。 平末端连接  修饰黏末端连接 ①同聚物加尾连接平末端DNA片段。 ②衔接物或接头分子连接平末端DNA片段。 ③PCR法引酶切位点的连接。 ① 平端的外源DNA分子用5’-特异核酸外切酶或能产生3 ’-突出末端的内切酶消化使其形成3 ’-端突出的DNA分子； ② 利用末端脱氧核昔酰转移酶在3 ’-端添加单核苷酸的功能，在外源片段3 ’-端形成一个单链延伸的尾巴poly(A)，载体同样处理后加互补的尾巴poly(T) ； ③二者混合靠互补的尾巴退火，由于互补尾巴长度不同，互补退火后会有一定的缺口； ④ 这种具缺口松弛的环状重组DNA分子导入宿主细胞后能够在胞内修复，因此可以不经连接直接导人宿主细胞中获得重组转化子。 衔接物或接头分子连接平末端DNA片段 　　　衔接物是由化学合成的，两个自相互补的核苷酸寡聚体。通常衔接物都含有一个或一个以上的限制酶切位点，它同时也是平末端双链寡核苷酸短片段。 PCR法引酶切位点的连接 连接条件的优化 (1)外源DNA片段与载体的连接方法的选择。 (2)提高重组率的方法。 重组ＤＮＡ分子的转化与转染 直接转化技术 电转化参数的确定 电转化感受态细胞的准备 　电转前，必须制备感受态细胞。用于电转化的宿主，要对其培养至对数期后，直接加以冷却、离心，然后用低盐缓冲液清洗，目的是要降低细胞悬液的离子强度。　　　 　　　然后用10％甘油重悬细胞，在干冰上速冻以后，放在-70度冰箱里可以长期贮存了。每一份存于-70度的细胞，都可以直接用于电转化。 显微注射转化技术 　　　显微注射，是用微吸管，先吸取供体DNA溶液，然后在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。 基因枪转化法 　　　基因枪转化技术，也称之为微弹转化技术 ，就是通过相应装置将携带基因的金属微粒高速射入细胞和细胞器的技术。 重组体克隆的筛选与鉴定 　　　　基因克隆的成功与否的关键，在于从转化的菌落中，将含有阳性重组子的菌落筛选出来，并且鉴定重组子的正确性。 在DNA连接时形成的多种转化子 遗传标志的表型特征来筛选转化子 决定表观形态的遗传物质，由两部分构成： 插入效应的筛选 插入失活 环丝氨酸筛选 蓝白显色筛选 　　在有些情况下，也可以通过插入载体的靶基因自身所携带的遗传表型，来对重组子进行鉴定。 载体提供选择植物或动物转化细胞常用的标记基因 　　　植物转基因经常用到的选择标记基因，包括：潮霉素磷酸转移酶基因，抗除草剂bar基因，荧光素酶基因等。 菌落的原位杂交筛选 　　　　菌落原位杂交是将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA。将DNA烘干固定于膜上与32P标记的探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号，并与平板上的菌落对位。 　　　　人们发明了三种固相支持体，用于裂解细菌菌落并进行原位杂交。包括：硝酸纤维素滤膜、尼龙膜和Whatman滤纸等。 菌落原位杂交示意图 原位杂交的筛选过程 核酸探针获取思路 核酸探针标记 免疫学筛选 PCR扩增鉴定筛选 　　酶切重组ＤＮＡ分子鉴定，与ＰＣＲ鉴定，都要依赖于电泳对产物的检测。 利用载体提供的表型特征筛选重组子 抗药性筛选 　　　大多数质粒载体都带有抗生素抗性基因，常见的，包括氨苄青霉素AMPr基因、四环素TETr基因、以及卡那霉素KANr基因等。 　　插入效应筛选，可以根据靶基因与载体的特异性连接，所引发的重组子性状变化，来鉴定这个外源的靶基因究竟是否连接到了载体的指定位置。 　　插入效应，包括三种类型：插入失活，插入表达，以及噬菌斑形成筛选。 　　插入失活，是由于核苷酸或一段外源性DNA插入到某个功能基因当中，从而引起了该基因的活性的丢失。 插入表达筛选 　　　有的载体中，外源基因进入载体特定位置后，会激活一些抗性基因。这些抗性基因通常会产生相应的遗传性状。因此，通过转化子的检测这些遗传性状，就可以鉴定重组子。 利用插入序列提供的表型特征筛选重组子 　　　动物的转基因，选用的标记基因更为复杂一些。 　　①待平板中的转化子菌落生长到人眼清晰可辨