基因工程第六章课件.ppt

第二节 基因转移的方法 第三节 重组体克隆的筛选与鉴定 * * 基 因 工 程 基 因 工 程 第六章?????重组基因向受体细胞导 入与重组子的筛选 目的基因与载体重组的方法 参见第三章 第一节 受体细胞的选择 受体细胞的概念 受体细胞(receptor cell)又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其维持稳定的细胞；从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 2. 受体细胞应具备的条件 (1)便于重组DNA分子的导入，如易形成感受态，具有较高的转化效率； (2) 能使重组体DNA分子稳定存在于细胞中，如限制性缺陷型RecB-，RecC-，hsdR-（外切、内切酶）； (3) 便于重组体的筛选，如具有与重组体互补的遗传性状； (4) 受体细胞遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长，能进行高密度培养；对动物细胞要可悬浮培养，对培养基适应性要好； (5)安全性高，无治病性，不会对外界环境造成生物污染：感染与寄生缺陷型； (6)蛋白水解酶要少，尤其是对枯草芽孢杆菌而言：选用内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低的细胞利于外源蛋白在细胞内的积累； (7) 受体细胞的密码子偏倚性要小； (8) 具有较好的翻译后加工机制，便于真核目的基因的高效表达例如：糖蛋白不能在大肠杆菌中表达； (9) 在理论研究和生产实践上有较高的应用价值； (10)对于用于基因扩增或基因高效表达的受体要用重组整合缺陷型RecA-。 3. 各种生物受体细胞的特性 3.1 原核生物细胞 这是较为理想的受体细胞类型，其原因是：(1)大部分原和生物细胞没有纤维素组成的坚硬的细胞壁，便于外源DNA的进入；(2)没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质，这为外源DNA与裸露的染色体DNA重组减少了麻烦；(3)基因组简单，不含线粒体和质体基因组，便于对引入的外源基因进行分析；(4)原核生物多为单细胞生物，容易获得一致性的实验材料，并且培养简单，繁殖迅速，实验周期短，重复实验快。 因此，原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库和cDNA文库，或者用来建立生产目的基因产物的工程菌，或作为克隆载体的宿主菌。基因工程上常用的原核受体有大肠杆菌、枯草杆菌和蓝细菌等。 3.1.1大肠杆菌 基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。优点：繁殖迅速，培养简便，代谢易于控制；载体系统完备；遗传背景清楚。已实现商品化的基因工程产品大部分是由大肠杆菌工程菌生产的，如人胰岛素、生长素和干扰素等。缺点：产生内毒素，可导致人体热原反应。 3.1.2 芽孢杆菌 作为基因工程受体菌的优势：具有胞外酶分泌调节基因，能将基因表达产物分泌到培养基中，且大多情况下，真核生物的异源重组蛋白经枯草杆菌分泌后便具有天然构像和生物活性；不产生内毒素，无致病性，是一种安全的工程菌；具有芽孢形成能力，易于保存和培养；繁殖迅速，培养简便，代谢易于控制，分子遗传学背景清楚。 缺点：胞外蛋白酶丰富。已成功表达人β干扰素，白细胞介素，乙型肝炎病毒核心抗原等。 3.2 真菌细胞 真菌是低等真核生物，其基因结构、表达机制及蛋白质的加工与分泌都具有真核生物的特征，因此利用真菌细胞表达高等动植物基因具有原核细胞受体不可比拟的优越性。常用的真菌细胞受体为酵母菌。 优势：结构简单，表达调控机理清楚，遗传操作相对较为简单；具有真核生物蛋白质翻译后修饰加工系统；不含特异性的病毒，不产生毒素，属安全型基因工程受体系统；繁殖迅速培养简单，利于大规模生产；能将外源基因表达产物分泌至培养基中，便于产物的提取和加工。蛋白质产物含量太高，基因表达产物难于分离纯化。 2.3 高等动物细胞 常用的受体有小鼠L细胞，HeLa细胞、猴肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞(CHO)等。 优点：能识别和除去外源真核基因中的内含子，剪接加工成成熟的mRNA；真核基因的表达蛋白在翻译后能被正确加工或修饰，产物具有良好的蛋白质免疫原性，约为酵母细胞的16-20倍；易被重组DNA转染，具有遗传稳定性和可重复性；可分泌表达。 缺点：组织培养技术要求高。 2.4 高等植物细胞 优点：细胞具有全能性，转基因细胞易于再分化形成植株；细胞培养简单。缺点：遗传操作困难繁琐。适用于植物基因的表达及植物品种的改良。已应用的受体有水稻、棉花、玉米、马铃薯、烟草等。 1. CaCl2处理后的细菌转化或转染 这是将重组的质粒或噬菌体DNA导入细菌中最常用的方法。作为受体细胞的细菌受体菌经一定浓度的冰冷的CaCl2溶液（50-100mM）处理后制备成感受态细胞(competent cells)，处于此状态的细胞具有摄取各种外源DNA