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基因工程载体 Made by lionchp 一 分类 依功能：克隆载体、表达载体、转录载体 ※克隆、表达的基本流程： 克隆载体 转录载体 DNA DNA RNA 蛋白质 表达载体 依组成：质粒、噬菌体、病毒、粘性载体、 人工染色体 ※可承载基因量：依次增大 依类型： 原核载体：质粒、噬菌体 真核载体：酵母、病毒 ※两类载体 分泌型载体：传导入受体细胞后，表达产生 蛋白产物释放出来的载体 穿梭载体：传导入受体细胞后，可在各细胞 间传递的载体 二 要求 可独立复制：有复制子 含多个酶切位点：利于双酶切 含抗性标记基因：利于重组体筛选 质量数小：可接合外源DNA的量大 三 结构组成 复制区：一个载体就是一个复制子 启动子：基因可表达 标志基因（例如抗药基因）： ※标志基因的作用： 四 质粒载体 结构：cccDNA（闭合、环状、共价） 分类： 根据复制类型 严紧型：一个细菌中不能有过多的该种质粒 松弛型：一个细菌中可有多个该种质粒（20个） 根据移动性（接合性） 转移型（接合型）：可通过性菌毛进入另一细菌 非转移型（非接合型）：不可通过性菌毛进入另一 细菌 根据作用 F质粒： R质粒： Col质粒： 命名：PBR322为例 P：质粒 BR：发现、构建该质粒的实验室/作者名首字 母简写 322：该质粒的实验编号 特征： 一个质粒就是一个复制子 不相容性：有相同复制起点和分配区的质 粒不能共存于一个宿主细胞中 几种常见的质粒载体 PBR322： PUC18/19： PGEM-3Z： PGEM-4Z： ※标志基因的应用 双酶切 方法：用两种不同的内切酶分别切目的片段 与载体，各自得到两个不同的黏性末 端 作用：目的片段可按顺序接合到载体上，单 酶切的载体两边是两个相同的黏性末 端，目的片段结合到载体上的顺序不 确定 抗性筛选 插入失活：目的基因插入载体时，插入到载 体的标记基因当中，破坏了该基 因，使此载体失去对应的抗性 应避免插入失活的原因：不插入失活时，培 养的细胞菌落培养基中加入一种抗生素（载 体上有对应抗性基因），能继续生长的菌落 为阳性克隆，即我们要的菌落 ※插入失活后的筛选：影印法培养细胞（A、B两个培养基中菌落位置分别相等），A中加入A抗生素，B中加入B抗生素 筛选出有A、B两抗性基因，但A被插入失活的 重组载体：A中的且B中不死的菌落为阳性克 隆，即我们要的菌落 蓝白斑筛选 原理：IPTG诱导LacZ（乳糖操纵子中）表 达出的酶可与X-gal成蓝色吲哚产物 α互补：载体上有α片段，菌体基因组中有LacZ’（LacZ缺α片段），阳性克隆菌便有完整LacZ，可加IPTG诱导产生酶，加X-gal成蓝色吲哚产物蓝斑，阴性克隆菌成白斑 五 噬菌体载体 λ噬菌体载体： M130噬菌体载体： 六 黏性载体 七 病毒载体 八 人工染色体 细菌人工染色体： 酵母人工染色体 本章总结