基因工程３课件.ppt

第二章 基因工程工具酶 2.1 限制性核酸内切酶 　　限制性核酸内切酶:识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸 。 限制性核酸内切酶类型 I型酶　　Ⅱ型酶　　　Ⅲ型酶 一些常见的Ⅱ型酶的识别序列和切割位点 　　　通过Ⅱ型限制性核酸内切酶的作用，产生的粘性末端，会有两种不同的类型。一种是在识别序列对称轴的左方和右方进行切割，形成带有凸出的5’磷酸基团的粘性末端，例如用EcoR I切割后就会形成这种粘性末端。 　　　另一种是在识别序列对称轴的两边进行切割，形成带有凸出的3’羟基基团的粘性末端，如Pst I。 同裂酶与同尾酶 　　有一些来源不同的限制酶，但能识别同样的核苷酸靶序列，这就是同裂酶 。 　　　虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。这就是同尾酶。 STAR活性  添加保护碱基 　　　限制性内切酶识别特定的DNA序列，除此之外，酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基，这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的，被称为保护碱基。 限制性核酸内切酶命名 ①限制酶的名称由三个字母组成。第一个字母采用细菌属名的第一个大写字母，第二和第三个字母采用细菌种名的前两个字母。 ②第四个字母是表示菌株的类型，若寄主菌有不同的株系，取菌株的第一个字母加入到酶名称中。 ③如果一个菌株中有几种限制酶，则在代表菌株的字母后用罗马数字表示。 ④当同属细菌中的不同细菌种名前两个字母完全相同时，一般取种名词头后的第一个字母来代替酶名字中的第三字母。（如溶血杆菌与流感嗜血杆菌 ） ①大多数酶的识别序列是很严格的，少数有变动的余地。（如HindⅡ的识别位点是一GTPyPuAC一，其中Py代表C或T，而Pu代表A或G。） ②识别序列的碱基数一般为4～6个碱基对，一般都富含GC。 ③大多数识别位点具有180。旋转对称性(或称为双重对称、回文结构。 ④ Ⅱ型限制性内切酶识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用。 　　限制酶识别序列的长短涉及对ＤＮＡ分子切割的频率，可以从理论上推导酶切DNA片段的大小。　　　　识别论点为4个碱基，则每隔256（44）个核苷酸就有一次机会出现这个识别序列。识别序列为六个碱基的限制酶，则每隔4096(46)个核苷酸，就会出现一次切割机会。　　  理论上有n个核苷酸的识别序列的出现概率为1／4n。 影响限制性核酸内切酶活性的因素 2.2 DNA连接酶 　　DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。 ＤＮＡ连接酶的性质 体外连接ＤＮＡ片段策略 ①直接连接具有互补粘性末端的DNA片段； ②用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来； ③先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来；或用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之后，再用DNA连接酶连接。 影响 DNA连接酶连接效率的因素 ①反应温度 ②T4DNA连接酶的用量 ③提高外源片段与载体的浓度的比值(10～20倍)。 2.3 DNA聚合酶 　　　DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。它是以DNA为复制模板，从将DNA由5‘端点开始复制到3’端的酶类。 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ Klenow聚合酶 逆转录酶 2.4修饰酶类 S1核酸酶 S1核酸酶主要作用于单链DNA或RNA，能使单链核酸分子快速降解。 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶。它通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基。 Ｔ４多核苷酸激酶 Ｔ４多核苷酸激酶，可以将ATP中γ磷酸基转移到具有5′端羟基的DNA或RNA分子上。 末端脱氧核苷酸转移酶 　　　　末端脱氧核苷酸转移酶，是不需要模板，以dNTP为底物催化脱氧核糖核苷酸依次加到DNA链(片段)3′-OH端的酶。 * * 粘性末端 平末端 　　Star活性又称星活性，是指由于反应条件不同而产生的切断与原来认识序列不同的位点的现象。 　　产生Star活性后，不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点。产生Star活性的结果是酶切条带增多。 抑制Star活性的方法 　　1. 尽量使用较少的酶进行完全消化反应。 　　2. 尽量避免有机溶剂 (如制备DNA