基因组学2）课件.ppt

华东理工大学生物科学专业核心课程 导论：基因组与基因组学 基因组图谱与基因组作图 基因组图谱与基因组作图 克隆指纹法（Clone fingerprinting）：重复序列指纹谱 单一克隆指纹谱 十克隆指纹图谱 第314号克隆片段 短小重复序列 第957号克隆片段 参照重复序列设计引物，进行PCR扩增： 凝胶电泳分离分析PCR扩增产物： 克隆指纹法（Clone fingerprinting）：序列标签位点指纹谱 序列标签位点（Sequence Tagged Site，STS）泛指基因组上序列唯一且已知的任何DNA序列，基因组图谱制作所使用的STS通常在100-500 表达序列标签（Expressed Sequence Tag，EST） 来自cDNA不完整序列，尤其是cDNA中的非翻译区，后者在同 简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR/SSLP） SSR/SSLP也是遗传图谱中的标记，注意：重复序列是唯一的。 随机基因组序列，从克隆的DNA中随机测序获得。 bp范围内。常见的STS有下列几种类型： 一家族的不同成员中往往具有专一性。 克隆指纹法（Clone fingerprinting）：序列标签位点指纹谱 第151号克隆片段 序列标签位点 STS 第738号克隆片段 克隆重叠群的识别与排序 参照STS设计引物，进行PCR扩增： 凝胶电泳分离分析PCR扩增产物： 序列标签位点 STS 2 C 基因组物理图谱的绘制 c 基于染色体区带定位的物理图谱绘制 利用染色体区带定位作图的工作原理 处于细胞分裂中期的人类染色体高度收缩，呈短棒状，分为端粒（Ter）、着丝粒（Cen）、短臂（p）、长臂（q）四大区域。多种荧光染料可与中期染色体特异性结合，构成不同的带型，可借助于显微镜识别整套染色体组，即染色 Ter Ter Cen p q 体核型分析（Karyotyping）。 2 C 基因组物理图谱的绘制 c 基于染色体区带定位的物理图谱绘制 利用染色体区带定位作图的工作原理 自染色体高分辨显带技术问世以来，虽然人们可在前中期和早前期的染色体上识别出成千上万条带型，但这一数值相对绘制物理图谱而言还远远不够，而且显色条带并不能与基因组序列或功能直接关联。不过受荧光染料染色的启发，将基因或DNA分子标记通过荧光显色标注在特定的染色体上，便形成了染色体区带 定位作图技术。 染色体荧光标记原位杂交技术 染色体原位杂交的精髓在于用DNA探针杂交结构完整的整条染色体，形成直观的染色体细胞图。当细胞样品在显微镜载玻片上干燥后，用 是FISH技术的关键部分。 Fluorescence In Situ Hybridization（FISH） FISH 技术的基本程序 甲酰胺处理，使染色体中的DNA变 性，同时保持中期的形态特征，这 染色体荧光标记原位杂交技术（FISH） Fluorescence In Situ Hybridization 染色体的伸展与选择 机械伸展的中期染色体：中期染色体呈高度压缩，因空间障碍不利于杂交，但在分离染色体时施加强大离心力，则可将正常的中期染色体拉长至原长度的20倍，由此能区分间隔为200-300kb的 完整染色体DNA：由分子梳理技术制备整条裸露DNA，精度10kb 分裂间期的染色体：包裹程度最低，杂交分辨率可达25kb，但染 相邻两个标记。 色体形态特征消失，可用于染色体局部区域内的标记标注。 染色体荧光标记原位杂交技术 用于FISH的探针通常使用基因文库中的克隆DNA片段，长100kb。目前已开发了数十种不同颜色的荧光染料，在灵敏度和分辨率的结合 上优于先前使用的同位素。由于所用的探针较长，且人类基因组上存在着大量的重复序列，因此为了避免探针可能存在的重复序列对杂交特异性的影响，通常在杂交之前先用富含重复序列的单链DNA预杂交探针。 Fluorescence In Situ Hybridization（FISH） 探针荧光标记与预杂交 染色体原位杂交图绘制 染色体荧光标记原位杂交技术（FISH） Fluorescence In Situ Hybridization A A A A A A A B C D D D D C D C C C C D D D D C C C C B 2 C 基因组物理图谱的绘制 d 基于染色体放射杂合的物理图谱绘制 利用染色体放射杂合作图的工作原理 人类细胞暴露于X射线中，其染色体会被随机打断，放射剂量越大，断裂片段就越小。而且，若将照射致死的人类细胞与正常的啮齿类动物（仓鼠）细胞融合，人的染色体碎片会随机插入到仓鼠基因组中，由此产生的融合细胞群称为放射杂合体组单个融合细胞中，每条染色体片段10Mb 利用染色体放射杂合作图的工作原理 染色