基因组学3）课件.ppt

华东理工大学生物科学专业核心课程 导论：基因组与基因组学 DNA连续序列的测序 DNA连续序列的测序 3 B DNA连续序列的组装 借助前述多种测序方法人们可以获得不超过1000bp的大量的DNA连续序列，但高等真核生物细胞内的一条染色体DNA就有数千万碱基对，因此要完成整条染色体基因组的总序列，必须将先前测序的大量DNA连续序列按一定的策略排列组装在一起，此类工作在基因组测序中被归为DNA连续序列的组装，简称序列组装（拼装）。序列组 装主要包括鸟枪法和克隆重叠群法两大战略。 3 B DNA连续序列的组装 a 基于鸟枪法的序列组装 鸟枪法组装基因组序列的基本原理 染色体基因组 基因组全序列 随机切断 分别测序 序列组装（比对重叠区） 连续测序片段 鸟枪法组装原核生物的小型基因组序列 原核生物的基因组中很少存在长于15bp的相同序列，因此理论上来说，只要两个基因组DNA随机片段的末端存在15bp以上的重叠区，那么基本上可以断定两者在染色体上是前后相连的关系。1995年由美国Celera Genomics公司发表的1830kb的流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）基因组序列就是在没有借助于任何遗传图谱或物理图谱 的条件下完成DNA连续序列组装的。 鸟枪法组装原核生物的小型基因组序列 采用高频超声波机械打断从细菌细胞中提取的基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳分离后，割取DNA片段长度在1.6-2.0kb范围内的凝胶区域，回收 流感嗜血杆菌基因组的测序程序 纯化其中的DNA片段。 鸟枪法组装原核生物的小型基因组序列 将上述1.6-2.0kb的DNA与质粒载体连接，转化大肠杆菌，构成流感嗜血杆菌的基因组文库。从文库中随机挑取19687个克隆，共进行了24304个有效的测序反应（有的克隆片段两端均测序），每个测序反应平均连续阅读480bp，总计测序长度相当于流感嗜 流感嗜血杆菌基因组的测序程序 血杆菌全基因组长度的6.4倍。 鸟枪法组装原核生物的小型基因组序列 上述24304条长度为480bp的DNA连续序列由一台RAM（随机存取存储器）为512M的电脑检索重叠区并据此加以序列组装，耗时30小时，最终得到140个序列重叠群（Sequence contig），它们各自代表流感嗜血 流感嗜血杆菌基因组的测序程序 杆菌基因组上不同的非重叠部分（即相互不贯通）： 流感嗜血杆菌基因组 140个序列重叠群 平均170条DNA连续序列 鸟枪法组装原核生物的小型基因组序列 两个相邻序列重叠群之间的序列间隙（Sequence gap）是指存在于基因组文库中但未能被组装的克隆序列。经查，在上述的流感嗜血杆菌基因组文库中共有99个克隆的两端序列横跨两个不同的序列重叠群，它们对贯通 序列间隙非常珍贵。 相邻序列重叠群之间序列间隙的贯通 序列重叠群 M 序列重叠群 N 克隆序列 m1 克隆序列 n1 设计探针 杂交文库 挑选呈双阳性克隆 采用内部引物测序 鸟枪法组装原核生物的小型基因组序列 相邻序列重叠群之 间物理间隙的贯通 流感嗜血杆菌基因组文库形成140个序列重叠群，共有141个间隙，99个序列间隙已经贯通，还有42个物理间隙，即不存在于基因组文库中的遗漏序列。贯通物理间隙的做法是利用噬菌体载体 物理间隙的克隆片段。 基因组文库，然后筛出包含 （装载量为25kb）构建第二 3 B DNA连续序列的组装 a 基于鸟枪法的序列组装 鸟枪法组装真核生物的大型基因组序列 受到流感嗜血杆菌基因组鸟枪法测序获得成功的鼓舞，Craig Venter及其同事又提出了真核生物多染色体的全基因组鸟枪法测序设想。然而，真核生物基因组更大，需要贯通的序列间隙和物理间隙会成倍增加；而且大多数真核生物基因组中还广泛存在着DNA重复序列，后者对DNA连续序列的组装会产生重大影响。因此，与原核细菌基因组序列的鸟枪法组装不同，真核生物大型基因组的组装必须借助于基因组图谱的指导。 3 B DNA连续序列的组装 a 基于鸟枪法的序列组装 鸟枪法组装真核生物的大型基因组序列 参照基因组图谱定位物理间隙 骨架 A 骨架 B 物理间隙 序列间隙 序列重叠群 构建第二基因组文库贯通骨架之间的物理间隙 骨架定位 两个相邻物理间隙之间的若干序列重叠群合称骨架，它们是序列组装的最初结果。首先可参照基因组图谱上的STS标记将骨架和物理间隙 定位在图谱上，然后贯通。 3 B DNA连续序列的组装 a 基于鸟枪法的序列组装 鸟枪法组装真核生物的大型基因组序列 大片段克隆区分重复序列 重复序列 重复序列 重复序列 重复序列 能正确组装 会错误组装 无法组装 含重复序列的DNA片段的组装必须本身长度大于最大的重复序列长度，否则将会发生组装