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比较基因组学 Cloning and identification of two novel NBCe1 splice variants from mouse reproductive tract tissues: A comparative study of NCBT genes 小鼠生殖道组织中两种新型NBCe1拼接变种的克隆和鉴定：NCBT基因的比较研究 摘 要 SLC4家族NCBT 在细胞pH调控以及HCO3-的跨上皮细胞转运中具有重要作用。 本实验用小鼠的生殖道组织进行系统的研究，它有5 种NCBTs以及五个NBCe1 （ SLC4A4 ）变种NBCe1 - A到E mRNA的表达，其中NBCe1 -D和NBCe1 -E是新的。克隆的NBCe1 -D和NBCe1 -E ，都缺乏一个27 碱基的序列，即 cassette I，揭示了一种新的替代老鼠SLC4a4基因的拼接单元。Slc4a4的合成（转录）缺乏cassette I,表示在不同的小鼠组织中，通过RT-PCR分析显示在不同组织中的其他脊椎动物种所示爆炸对GenBank数据库。基因组序列分析表明，cassette I SLC4a4保护所有NCBT基因的除了SLC4A5 ，因为slc4a5大概在它进化中丢失了cassette I。 我们现在的研究结果也表明我们正向未知的NBCe1分子生理学和未确定的其他NCBTs迈出的重要一步。 1、介绍 调制生殖道组织细胞液的碳酸氢盐浓度[HCO3- ]及pH值是哺乳动物的繁殖整个过程的关键。由微注射研究， Levine和Marsh表明，细胞腔[HCO3- ]从曲细精管20 毫米大幅减少到附睾头的2.7毫米，然后在尾附睾和输精管的[27]逐渐上升到? 6.7毫米。在细胞腔液中相对酸性pH值和低[HCO3- ]是必不可少的渲染在附睾静态精子。 HCO3- 是精子获能的重要因素之一。在女性生殖道内， HCO3- 进入精子，激活精子可溶性苷酸环化酶，反过来又增加细胞内cAMP [12]的水平。 女性生殖道管腔液中的[HCO3- ]可高于血浆中的2 - 4倍，说明子宫内膜上皮细胞能执行大量HCO3- 分泌。 在哺乳动物生殖中pH和HCO3-的重要意义，极为重要的是要了解HCO3-分子机制在男性/女性生殖道上皮细胞的运输。在生殖道参与HCO3-跨上皮细胞转运的分子实体很大程度上仍不清楚。该五钠耦合HCO3- 的转运（NCBTs）的溶质载体4（SLC4）家族是一类主要的运营商为HCO3- 运输，并且在调节pH以及HCO3-的跨上皮细胞转运中具有重要作用。 NCBTs包括（a）两个产电的成员NBCe1（SLC4A4）和NBCe2（SLC4A5），及（b）3个电中性的成员NBCn1（SLC4A7），NBCn2（SLC4A10，又名NCBE），及作为一个Na +驱动Cl-/HCO3- 交换NDCBE（SLC4A8）。 由于选择性剪接或使用不同启动子进行转录，几乎所有NCBT的基因都能够产生多个变体。例如，SLC4A4基因（a）有两个不同的启动子，这允许该基因编码两种类型的氨基末端（Nt），和（b）一种已知的选择性剪接单元，即外显子24，其允许该基因编码两种类型的羧基末端（CT）。根据这两个已知的变化，SLC4A4基因可以产生高达四个变种。迄今为止，三个NBCe1变种NBCe1-A，-B，-C，已经从人类和啮齿动物中发现。 NBCe1-A具有独特的短氨基末端，而NBCe1-B / C有很长的NT。 由于存在的外显子24的含有一个终止密码子，NBCe1-A / B有一个短CT，而由于24号外显子的缺失NBCe1-C有独特的长CT。 在本研究中，我们利用反向转录聚合酶链反应（RT-PCR）系统地研究小鼠生殖道组织中的五个NCBTs的表达。此外，我们审查了NBCe1变种组织在雌性和雄性小鼠中的表达和分布。我们确定了两个新NBCe1变体，即NBCe1-D和NBCe1-E，这两者缺乏9氨基酸卡带，指定为cassette I，在NT NBCe1。通过基因检测基因组DNA分析来测试cassette I在其他NCBT的演变。 2、方法 2.1、组织采集和RNA分离 收集老鼠生殖道组织，立即在液氮中冷冻，然后保存于-80°C，直到被用于RNA制备。 按照制造商的说明制备总RNA的TRIzol试剂。从2-4只小鼠提取约100 – 200mg的组织，放入盛有2毫升TRIzol试剂的容器，然后立即摇匀。然后将匀浆物在12000×g下离心5分钟，在4℃下该水相转移到一个干净的试管中，加入萃取氯仿中，然后离心12,000×g下15分钟，在4℃下该得到的水溶液phasewas保存和mixedwith异丙