实验核医学第四章）课件.ppt

第一节 基本概念 1.放射性浓度──单位体积溶液中含有的放射性活度，Bq/L、Bq/ml。 2.放射化学纯度──放射性标记化合物的放射性活度占该样品的总放射性活度的百分比。 3.放射性比活度──单位质量放射性物质的放射性比活度。重要参数，根据实验设计要求。 第二节 标记化合物的制备 一、放射性核素的选择 1.基本不改变原有化合物的物理化学性质； 2.标记核素与化合物的结合牢固、稳定性好； 3.合适的半衰期； 4.射线容易测量； 5.其它，标记难易、价格、防护等。 第三节 常用标记化合物的制备 C、H──生命物质的主要组分，生命科学中常用14C、3H来标记所需化合物。 125I ──性质活泼，易与蛋白质和多肽发生取代反应，且发射的γ射线易测量。 P、S──核酸、蛋白质的组成元素， 32P、33P、35S在DNA测序等分子生物学中广泛应用。 第四节 纯化与鉴定 放射性核素检测的灵敏性，应用时的微量，都必需要求标记化合物的放射化学纯度达到一定的高度（至少大于95％），这样才能达到实验目的，结果才可靠。 杂质来源： ①未标记上的游离放射性核素； ②待标记物的不纯物被标记上放射性核素； ③贮存时，由于标记物的不稳定，或发生辐射自分解，产品性质、结构发生变化。 第五节 放射性标记化合物的辐射自分解 辐射自分解：由于标记化合物分子所含放射性核素的电离辐射作用，致使标记化合物分子本身的结构被破坏而丧失原有特性的现象。 一般还会产生放射化学杂质或化学杂质。 在制备和贮存放射性标记化合物时应充分注意。 影响碘化反应因素： 1.可结合基团数量，及暴露程度； 2.氧化剂性质、反应条件(pH、浓度、温度、反应时间)。 一般来说，在保证一定标记率得前提下，尽可能减少氧化物得用量，以保证标记物得生物活性和免疫活性。 碘化反应种类： 1.氯胺-T法： 方法简便，标记率高，重复性好，试剂易得，是迄今最常用方法之一。 Cl-T（N-氯代对甲苯磺酰胺钠盐）：性质温和，在水溶液中水解产生次氯酸，次氯酸氧化碘离子成碘分子。 注意事项： ①氧化剂Cl-T不稳定，临用时配置； ②用量适当； ③反应完需用等量的还原剂偏重亚硫酸钠（Na2S2O5)中和,临用时配置； ④pH在7～8，常用0.2～0.5M磷酸缓冲液； ⑤反应体积适当，50～300μl； ⑥温度和时间，室温1～3min，若4℃，增加时间； ⑦不适用于生物活性不稳定物质，如一些补体、某些激素、酶、受体等。 2.乳过氧化物酶法（LPO）： 过氧化物酶作用于H2O2，放出新生态氧，氧化125I-为碘分子。常用乳过氧化物酶。 注意事项： ①用量少，为待标记蛋白的1％； ②pH范围较宽，4～8.5； ③H2O2用量少； ④反应时间30～60min ⑤也能用于各种脂肪、细胞、细胞膜的标记； ⑥过氧化物酶来源困难，标记率低； ⑦酶本身也可能被标记而产生杂质。 3.固相氧化法： 将氧化物或过氧化物酶以固体的形式，或制成固体颗粒，进行液-固氧化反应。 目前常用Iodogen法。 Iodogen：1,3,4,6-四氯3α,6α-二苯-甘脲，氧化剂，与Cl-T同属氯酰胺类。 注意事项： ①Iodogen不溶于水，可用二氯甲烷溶解； ②制备Iodogen涂管（5～25μg/管），封口冷藏； ③无需配置氧化剂、还原剂 ④将反应液倒出或稀释，即终止反应； ⑤对标记物损伤程度小，标记率较高。 4.联接标记法： 间接标记法。先将放射性碘标记到较活泼试剂上，再联接到待标记化合物上。 常用Bolton-Hunter试剂，3-(对-羟基苯)丙酸-N-琥珀亚胺酯（HPNS）。 步骤：①125I标记HPNS；②125I-HPNS上的酰基与蛋白质或多肽上的游离氨基发生缩合反应。 可避免蛋白质与氧化剂直接接触，防止生物活性损伤；对于在体内不稳定的酪氨酸残基碘标记物，提供一种选择。 较麻烦，引入一较大基团会影响示踪性质。 四、32P、33P和35S标记化合物的制备 32P：射线能量较强（1.7MeV），易检测，但辐射危害大，半衰期短（14d），自显影条带有扩散，分辨率低； 35S：能量较低（0.167MeV），半衰期较长(87d)，自显影条带清晰，分辨率高，无需特殊防护，自显影前需制成凝胶干胶板； 33P：能量适中（0.25MeV），半衰期为25d，自显影清晰度、分辨率适中，无需特殊防护。 制备方法：化学合成、生物合成、酶促法、同位素交换法。现一