生物化学与分子生物学技术原理-12-6课件.ppt

* SWAU ②、测量相对迁移率(Rf):分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。测定迁移率时，在电泳结束后要先在指示剂移动的位置(前沿)作一标记(通常是插一根短铜丝)，染色后，量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。 Rf＝ 谱带迁移距离/ 前沿指示剂迁移距离 测量迁移率时，应以谱带的中部位置为准，值得注意的是，交联剂的浓度，交联剂和丙烯酰胺的比例，催化剂浓度及聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响，因而会影响迁移率。另外，电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移速度。为了使试验重复性好，这些因子都应尽可能保持恒定。 * SWAU ③照相：采用透射照相方法，用照相机把谱带真实地拍摄下来，盘状电泳的凝胶柱一般放在试管中(注满脱色液或保存液)拍摄。对于绿色、蓝色和暗蓝色的染色区带，照相时可加黄滤色镜，能增加清晰度。 ④光密度计扫描定量：把谱带放在光密度扫描仪上，描绘谱带——光密度曲线。配合计算机，可作定量分析。 * SWAU 第四节 SDS一、原理 SDS(sodium dodecyl sulfate)，H25C12NaSO4 M＝288.38g/mol，是一种很强的阴离子表面活性剂。SDS能破坏蛋白质分子间的结构(尤其是在强还原剂如巯基乙醇存在下，使蛋白质分子内的二硫键还原打开)，并以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合，形成牢固的带负电荷的蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。所引入的净电荷大约为蛋白质本身的净电荷的10倍，使得其所带电荷远超过蛋白质原有的净电荷，从而清除不同蛋白质之间所带的净电荷不同对电泳迁移率的影响。 SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变，由蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为10A，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。 这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，迁移率只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数 测定时，通常选用已知分子量的标准蛋白质作为“标记物”(maker)，与分子量未知的待测蛋白质样品在同一条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝焦电泳，作出已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率标准曲线，，从标准曲线上根据迁移率找出待测蛋白质样品的分子量。 * SWAU 二、设备 1、凝胶电泳装置 2、电源 3、100度的沸水 4、Eppendorf管 5、微量注射器（50 or100ul） 6、干胶器 7、带盖的玻璃 or塑料小容器 * SWAU 三、操作步骤 1、制胶 2、样品准备与上样 3、电泳 4、固定、染色、脱色 5、分子量测定 * SWAU 四、应用 1、蛋白质纯度的分析 2、蛋白质分子量的测定 3、蛋白质水解的分析 4、免疫沉淀蛋白的鉴定 5、免疫印迹的第一步 6、蛋白质修饰的鉴定 7、分离放射性标记的蛋白 * SWAU 第五节 连续密度梯度电泳 一、原理：如果合成的聚丙烯酰胺凝胶从上至下是一个正的线性梯度凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐缩小的方向迁移。随着电泳的继续进行，蛋白质受到孔径的阻力越大。电泳开始时，样品在凝胶中的迁移速度主要受到两个因素的影响：一是样品本身的电荷密度，二是样品分子的大小。当迁移所受到的阻力大到阻以使样品分子完全停止前进时，那些跑得很慢的低电荷的样品分子将赶上与它大小相同但具有较高电荷密度的分子并停留下来形成区带。因此在梯度凝胶电泳中，样品的最终迁移位置仅取决于分子本身的大小，而与样品分子的电荷密度无关。样品混合物中分子质量大小不同的组分，电泳之后将依分子质量大小停留在不同的凝胶孔径层次中形成相应的区带。 * SWAU 二、连续密度梯度电泳的优点 1、具有使样品中各个组分浓缩的作用，稀释的样品可以分次上样，不会影响分离效果 2、可提供清晰的谱带，适合纯度鉴定 3、可在一张胶片上同时测定分子质量分布范围相当大的多种蛋白质的分子质量 4、可以测定天然状态蛋白质的分子质量 * SWAU 第六节 等电聚焦电泳 等电聚焦(isoelectric focusing)，缩写为IEF或EF，也称等电分离、等电点划分，等电点分析、聚焦电泳等，是六十年代后期才发展起来的电泳技术，它不仅用来分离、鉴定和测定蛋白质等电点，分离复合蛋白，同时还可以结合SDS电泳，密度梯度和一般凝胶电泳进行双向电泳来分析蛋白质的亚基，分子大小和各种蛋白质成分的图谱。 因此，它已成为电泳中不可缺少的技