生物学实验技术第一、二章课件.ppt

现代生物学试验技术 第一章 绪论 现代生物技术包括 1、基因工程 2、细胞工程 3、蛋白质工程 4、发酵工程 5、酶工程 6、生物化学工程 7、生物医学工程 8、...... 发酵工程 第二章 细胞培养 细胞培养所用玻璃及塑料品的清洗与消毒 清洗 在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长 微生物产品附带杂物 上次细胞残留物 非营养成分的化学物质 需要清洗的培养用品 玻璃器皿的清洗 胶塞的清洗 塑料制品的清洗 玻璃器皿的清洗 包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤 清洗后的玻璃器皿 干净透明无油迹 不能残留任何物质 浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉 新的初次使用的玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量的干固的灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害的物质等 先用自来水简单刷洗，然后晾干，再浸酸 再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的蛋白质，干固后不易洗掉 用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上 刷洗 用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质 透明的塑料制品刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度 浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中 清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质 浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面 浸泡时间：一般为过夜，不应少于6 小时 清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 63∶1000∶200000 次强清洗液 120∶200∶1000 弱清洁液 100∶100∶100 配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色 冲洗 在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽量不留污染或清洁液的残迹 最好用洗涤装置 如用手工操作 需流水冲洗二十次，每次水须灌满及倒干净，最好用蒸馏水清洗3-5 次，三蒸水清洗3次，晾干或烘干备用 胶塞的清洗 新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理 常规清洗方法 每次用后立即置入水中浸泡，用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分钟（以除掉培养中的蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用 塑料制品的清洗 塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品 必要时用2% NaOH 浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30 分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用 消毒 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染 常见原因： 操作间或周围空间的不洁 培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底 由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染 消毒灭菌方法 物理消毒灭菌法 紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿，30min 湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min 干烤：160℃, 2 小时 过滤：0.22μm 化学消毒灭菌法 70%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理 1‰新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 抗生素 主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染 化学消毒法 70%酒精 主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理 1‰新洁尔灭 主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒 细胞培养常用物品 细胞培养基 市场上可提供干粉培养基和液体培养基 干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格便宜。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制 液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不仅质量得到保证，而且使用十分方便 常用的培养基种类 RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys 5A、M199、F10等 血清 热灭活：56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清 热灭活目的：灭活血清中的补体成分。除非必须，一般不建议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清的质量 血清中的沉淀物 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批号的血清