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* * 现代组织化学技术主编：袁新初 武科大医学院组胚教研室 课程简介：在形态学基础上研究细胞或组织中物质的化学组成、定位、定量及代谢状态的科学。 课程性质：选修课 学 时：18学时，其中考试2学 考试形式：开卷考试 第一章 组织学切片技术 第一节 组织取材与固定 一、动物的处死 1、麻醉: 对小动物可将浸有乙醚的棉球与小动物同时密封于玻璃容器。较大动物静脉注射4%戊巴比妥（1ml/kg体重）或腹腔内注射20%氨基甲酸乙酯（5ml/kg体重）。 2、空气栓塞: 较大动物如兔，用较大空针从耳静脉将空气一次推入。 3、颈椎脱臼或断头: 适用于小动物 4、股动物放血 : 将动物麻醉，切开股动脉放血。 二、取材 所取组织细胞必须越新鲜越好，防止组织变性、挤压、破碎，组织块不宜太大，光镜标本不超过1cm×1cm×0.3cm, 电镜标本约在0.5mm左右，条件允许时应低温操作（0~4℃）。 冰冻切片材料取材后如不能立即进行冰冻切片则应立即用液氮速冻，-70℃或-40℃低温冰箱保存。 液氮组织速冻方法：取出后，用铝箔包好，编号存入液氮罐或-70℃冰箱保存。可保存数月至数年。如短期内应用，可保存于-30℃冰箱。 三、固定 一)固定的意义 将组织浸入某些化学试剂，使细胞内的物质尽量接近其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称为“固定”。 固定的作用在于： ①保持细胞与生活时的形态相似，防止自溶与腐败。 ②保持细胞内特殊的成分与生活状态时相仿： ③便于区别不同组织成分；组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别。 ④有利于切片：固定剂有硬化作用，使组织硬度增加，便于制片。 影响固定的因素： ①影响常规染色：如用福尔马林固定时，常有福尔马林色素的异常沉积。 ②固定造成物质损失：不同的固定剂和固定方法会引起不同程度的细胞内蛋白质、粘多糖、脂类、核酸和低分子量物质的损失，因此应根据研究目的的不同选择合适的固定剂和固定方法，以使所研究的物质损失达到最小。 ③组织皱缩。 二）固定液 （一）单纯固定液 1、甲醛（formaldehyde）： 是一种约有40%重量溶于水的气体，易挥发。市面上出售的为40%的甲醛水溶液，也称为福尔马林(formalin)。一般作为固定剂使用的10%的甲醛，是用水和40%甲醛（9：1）混合而成，实际上是4%甲醛。 甲醛能与蛋白质中的许多氨基酸反应，如赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。并能保存脂类和类脂体，但必须用冰冻切片法。也可固定高尔基体、线粒体，是糖的保护剂。 2、重铬酸钾： 橘红色结晶，具有毒性，常用其1%~3%水溶液作为固定剂。重铬酸钾常用于混合固定液，如Zenker液、Helly液、Maximov液等。 3、苦味酸： 黄色结晶体，是一种强酸，易燃易爆。苦味酸能沉淀一切蛋白质，穿透慢，组织收缩明显，但组织无明显硬化。对脂肪和类脂无固定作用，用乙醇溶解可固定糖类。用含苦味酸的固定液固定组织时，时间不宜超过24小时，固定后的组织应尽快放入70%酒精，并在酒精中滴加少量饱和碳酸锂水溶液或浓氨水，有助于除去苦味酸固定产生的黄色。 4、升汞： 一般用其5%~7%饱和水溶液作为固定剂，单独应用组织收缩显著，因此常与醋酸和铬盐配成混合固定液使用。升汞的穿透能力低，只宜固定薄片组织。对蛋白质有沉淀作用，可固定蛋白质，但对类脂和糖类无固定作用。 5、丙酮： 为易挥发易燃的无色液体，可与水、醇、 和醚等混合。可使蛋白质沉淀，渗透力强，对核的固定差。广泛用于酶组织化学方法中各种酶的固定。 （二）混合固定液： 根据对组织的作用与反应，配成混合固定液，以求得补偿某试剂对组织所致的缺陷。 1、Bouin液 是一种常规用于外科活检标本固定的良好固定液。用于固定大多数器官和组织，固定效果好，组织细胞结构完整。细胞核着色鲜明，但细胞质着色较差。 2、Carnoy液 固定胞浆和细胞核，对于染色体固定佳，显示DNA和RNA效果好，也常用于糖原和尼氏体的固定。但不能保存脂类。 3、Zenker液 为形态学研究常用的固定液。可用于固定多种组织，使细胞核和细胞质染色较清晰。 4、Helly液 该固定液对细胞质固定好，显示某些细胞质内特殊颗粒有独特优越性。 5、甲醛-钙液 特别适用于固定脂肪组织和组织化学染色。配方：甲醛10 ml，无水氯化钙1g，蒸馏水90ml。 6、中性缓冲甲醛液 为