菌种的复壮与保藏课件.ppt

第二章 菌种的退化、复壮与保藏 第一节 菌种的退化和复壮 一、菌种的退化 （一）原因 菌种保藏不妥 菌种生长的条件要求没有得到满足 自身突变和自发突变 （二）菌种退化的表现 生产性状劣化，遗传标记丢失，原有的典型性状变得不典型。 菌落及细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越小； 代谢产物生产能力下降； 抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱 总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优势。 （三）菌种退化的防治 从菌种选育方面考虑 1)尽量使用孢子或单核菌株 2)诱变处理后的菌株应充分的分离纯化，保证获得菌株的纯度。 二、菌种的复壮 侠义的复壮：菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。 广义的复壮：一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐步提高。 对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化 淘汰衰退的个体 通过寄主体内进行复壮 改变培养条件 诱变剂处理 世界上国际知识产权组织承认的法定保藏机构有28家。 Ex：美国的标准菌种保藏所（ATCC） 美国农业部农业研究服务部（ARS） 英国国立标准菌种保藏所（NCTC） 我国：1 普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC） 2 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC） 3 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC） 4 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC） 5 抗生素菌种保藏管理中心（CACC） 6 兽医微生物菌种保藏管理中心 （CVCC） 二、微生物菌种保藏技术 原理：根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使孢子或菌体处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温等。 斜面保藏法 接种适宜斜面培养基 →培养→4℃保藏 适用：各大类 保藏期：3~6个月 缺点：保存期短，传代多，易退化 培养： 　　将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为30～37℃，真菌培养温度一般为25～28℃。 保藏： 　　培养好的菌种于4～6℃保存，根据要求每3～6个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须1～3个月移植一次。 　　保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%～70%。 　　斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。 半固体穿刺保藏法 穿刺接种适宜半固体→培养→4℃保藏 适用：好气性细菌，酵母等 保藏期：6~12个月 用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待微生物生长良好后覆盖2~3mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物.如固氮菌、分枝杆菌等。 砂土管干燥保藏法 措施：无营养，缺氧，干燥 方法：孢子或芽孢悬液 → 加入无菌砂土管中→ 干燥→ 封口 → 5℃保藏 适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌 保藏期：2~10年或更长 向培养好的斜面培养物中注入3～5mL无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。 真空抽去沙土管中水分。 将沙土管用火焰熔封后存放于低温(4～6℃)干燥处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。　 保藏时间2～10年。 真空冷冻干燥保藏法： 措施：低温、干燥，缺氧，保护剂 方法：菌种培养 → 用保护剂悬浮→ 加入安醅管中→低温冻结（-25~-40℃）→ 抽真空→ 真空封口 → 4-5℃保藏 适用：各大类 保藏期：5~10年或更长 基本程序 1安瓿管的处理 直径8~10mm，长度不小于100mm，洗净高压备用。 2 保护剂 低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。 3 菌悬液制备 最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。一般细菌24~48h，酵母72h，放线菌和丝状真菌7~10d。 4 冷冻干燥 5 安瓿管的保藏 4-5℃保藏 复苏方法： —— 先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部， —— 将安瓿管顶部烧热， —— 用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹