质量标准中有关物质测定方法的建立课件.ppt

2001年5月 药品研究及生产过程中有关物质的控制方法和要求 化学二室 谢沐风 2005年4月 有关物质的来源 原料药合成过程中带入; 制剂过程中产生; 或是在贮藏、运输、使用过程中产生。 控制的必要性 高效液相色谱法（HPLC法） 1 .色谱条件的确定（即专属性试验） 专属性是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，通常采用在纯物质（原料或制剂）中加入一定量的杂质或辅料，证明各杂质均可与被分析物分离。 配制含有1%(w/w)浓度各中间体（即各杂质）的主成分对照品溶液作为系统适用性试验用溶液，来确证色谱条件的适用性。 专属性试验验证图谱 2 . 检测波长的确定 涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分） 选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。 选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f1.0），这样可更加严格控制杂质的限度。 如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f1.0），否则将得到错误的判断。 目前国外有关该项研究的进展 3. 供试品溶液浓度的确定 （灵敏度试验——最低检出量的测定） 供试品溶液浓度的设定至关重要。通常其设定是依据最低检出量和最大进样量来进行的。 最低检出量虽然是个绝对值，但其真正的意义确是其相对值，即相对于供试品溶液中样品浓度的多少而言。 其测定方法分为直观评价法和依据信躁比两种方法。 最大进样量以不断增加样品溶液浓度，直至被分析物不拖尾的浓度为准。 3. 供试品溶液浓度的确定 设定杂质总量不得过1.0%，最低检出量通常需达到对照溶液浓度的1/10~1/50（即相当于供试品溶液浓度的0.1%~0.02%）。也就是说供试品溶液的浓度至少是最低检出量的1000倍~ 20000 倍，又由于最低检出量受各因素的不同而改变（即耐受性因数），故供试品溶液的浓度在保证不拖尾的情况下（即小于最大进样量），可在此基础上再设定的高一些，以保证该浓度可适用各种条件。 3. 供试品溶液浓度的确定 举例说明：进样量为20μl，主成分的最低检出量为1μg/ml（以浓度表示），规定杂质限度为1%，此时供试品溶液的浓度可设定为 1mg/ml ~20mg/ml，或者再高一些，但始终需保持主成分峰不拖尾为准，即不超过最大进样量。 拖尾情况也可通过流速进行适当调节 3. 供试品溶液浓度的确定 4. 加样回收试验（即准确性试验） 准确性试验可采用样品中加入已知量杂质的方式来评价。准确称量各杂质，将含有1% (w/w)浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用的色谱条件是否可分离检出出相应的各杂质。该原理同前面所述的专属性研究是一致的。 5. 流速、柱温与溶剂的选择 在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成分峰不拖尾即可。 柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。 溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对照溶液的主成分峰面积精密度良好。 6. 积分参数的设定 积分参数的设定是非常重要的。它主要由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(Min Area)组成。 采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。 这里主要是供试品溶液的最小峰面积设定，它将直接导致测定结果。设定的太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定的太大，又将反应不出杂质的存在情况。 6. 最小峰面积的设定 其设定，不是绝对值，而是相对值。 英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为1/10~ 1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。 同时请大家注意，在进行原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。 7. 保留时间的设定 经过上述方法学认证后，确定供试品溶液的保留时间，通常以洗脱出全部杂质和经强力破坏试验出的杂质，规定至主成分保留时间的几倍为止。 8. 强力破坏试验 水破坏 取原料适量，加水溶解后，在90℃放置24小时。 氧化破坏