分子生物学实验-实验操作课件.pptVIP

重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建 分子生物学实验-实验操作 基因、载体、受体菌株 实验技术要求 应掌握的实验技术 酶切,连接 凝胶回收 制备感受态细胞 质粒提取 PCR 琼脂糖凝胶电泳 考察指标 电泳 电泳 感受态细胞转化率 电泳 电泳 电泳 实验流程: 第一天 实验流程: 第二天 实验流程: 第三天 实验流程: 第四天 双酶切反应（20μL体系） rhIL-18的PCR产物 PCR产物 10μL Buffer O 2μL 无菌水 7μL BglⅡ 0.5μL PstⅠ 0.5μL 质粒pUC18 质粒 10μL BamHⅠ Buffer 2μL 无菌水 6.7μL BamHⅠ 0.3μL PstⅠ 1μL Hybrid site 培养基配制 LB液体培养基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 5g 调节pH到7.0 LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂 每组准备： 1个30ml 液体培养基 灭菌 1个30ml LB 液体培养基 微量移液器枪头（200uL） 琼脂糖电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。 DNA 的分子大小 琼脂糖浓度 DNA 分子的构象 电源电压 嵌入染料的存在 离子强度影响 琼脂糖凝胶回收 琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒 分别对： 目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收 载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收 琼脂糖凝胶回收 1.通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他片段尽可能分开，然后用干净的手术刀切下含需回收DNA的琼脂块，放入Ep管。 2.按300μL/100mg（3:1）的比例加入 Binding BufferⅡ，置于50-60℃水浴中10min，使凝胶彻底融化。期间，每2 min混匀一次。 3.将融化的溶胶液转移到套在 2-ml 收集管的UNIQ-10柱中，室温放置 2 min。12000 rpm 室温离心 1 min。 4.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μL Wash Solution，12000 rpm 室温离心 1 min。 5.重复步骤4一次。 6.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放入同一个收集管中，12000 rpm 室温离心 2 min。 7.将 UNIQ-10 柱放入一根新的 Ep 管中，在柱子膜中央加30μL Elution Buffer，60℃放置 5min。 8.12000 rpm 室温离心 1 min ，离心管中的液体即为回收的DNA片段。 从溶液中回收DNA： 根据溶液的体积，加入 3 倍体积的 Binding BufferⅡ混匀。 以下操作参照琼脂糖凝胶中回收DNA步骤3-8. 计算基因与载体片段比例 紫外下观察基因与载体片段的亮度 基因的摩尔数≈基因片段亮度/碱基数（495bp） 载体的摩尔数≈载体片段亮度/碱基数（2700bp） 基因摩尔数/载体摩尔数 最佳比例是3：1 连接反应 ⑴ 在灭菌的0.2mL离心管（PCR管）中进行⑵ 20μL体积反应体系中： 10×快速连接缓冲液 2μL rhIL-18双酶切产物 X μL 质粒pUC18双酶切产物 Y μL T4-DNA连接酶 1μL 20℃1h，4 ℃过夜 感受态菌的制备 （1）E.coli DH5α菌株37℃过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液0.3mL加入到30 mL LB培养基中，37℃，230 r/min振荡培养3 h，至OD600约为0.4左右。 （2）无菌条件下，将50mL菌液转移至离心管中，冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。 （3）在预冷4℃的离心机上以4000r/min离心10min，弃去上清，加入30mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴上放置10 min。 （4）以4000r/min在4℃离心10min，弃去上清，每30mL初始培养物用1.0mL预冷的0.1