分子生物学实验操作方法与技巧2）课件.ppt

分子生物学与生物化学实验操作、设计与技能 质粒提取技巧及常见问题分析 李刚 副教授 试剂盒提质粒的原理 国内外绝大部分的质粒抽提试剂盒使用的都是碱裂解法结合硅胶柱纯化技术。首先利用碱法中的试剂裂解细胞。裂解后的细胞液加入硅胶柱中。硅胶柱中使用了一种特殊的玻璃纤维滤膜，这种滤膜在高离子溶液剂（盐酸胍，NaI, NaClO4）的条件下，可以同核酸发生吸附反应，而在低盐条件下，核酸又可以从滤膜中释放出来，蛋白质和其它杂质不会被吸附，从而达到纯化核酸的目的。硅胶柱将核酸抽提或纯化变成一种简单的过滤操作，以取代传统溶液型抽提技术的离心方式。硅胶柱的过滤吸附操作大大减少了抽提过程中离心和干燥时间，并去除耗时的醇类沉淀过程。此外，硅胶柱还第一次提供了一种高通量的纯化方式，大大加速了各种高通量筛选的科研项目，各种96孔板或384孔板的纯化方式纷纷出现。至目前为止，硅胶柱已经成为目前核酸分离纯化中最主流的技术。 0.5M EDTA母液的配制 配制量：1L。 配制方法： 1．称取186.1g Na2EDTA·2H2O置于1L烧杯中。 2．加入800ml的去离子水，置于磁力搅拌器上充分???搅拌。 3．用NaOH调节pH值至8.0（约需20g NaOH），当pH 接近8.0时， EDTA方可完全溶解，加入去离子水 定容至1L。 4．小份分装后，高温高压（121?C，20分钟）灭 菌，室温保存。 溶液II的配制 溶液II：0.2N NaOH ， 1% SDS 配制： 500 ml 10% SDS 50 ml 2N NaOH 50 ml(也可用10N NaOH稀释) 取以上溶液，用灭菌去离子水定容至500 ml，充分混匀。室温保存（不需灭菌）。此溶液保存时间最好不超过一个月，最好现用现配。 注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 溶液III的配制 溶液 III ：3 M 醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 5.6。 5 M 冰醋酸。 配制：500 ml 醋酸钾 147 g 冰醋酸 57.5 ml 加入300 ml去离子水后搅拌溶解。待醋酸钾溶解后，再加去离子水将溶液定容至500 ml。高温高压（121?C，20分钟）灭菌后，4℃保存。 TE缓冲液（pH 8.0）的配制 10×TE缓冲液（pH 8.0）：100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA (pH 8.0) 。 配制：1000 ml 1 M Tris-HCl 缓冲液(pH 8.0) 100 ml 500 mM EDTA (pH 8.0) 20 ml 加入约800 ml的去离子水，均匀混合。溶液定容至1 L。高温高压（121?C，20分钟）灭菌后，4℃保存。 苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)的配制 量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡过的苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。 两个常见问题： 1、Tris饱和的酚和水饱和的酚有什么区 别？ 2、配好的苯酚/氯仿/异戊醇为什么会分 层？应该用上层还是下层去纯化DNA？ 分子生物学常用的苯酚种类 1、水饱和酚。 水饱和酚又叫水平衡酚。水饱和酚的pH小于7，通常与异硫氢酸胍一起使用，用于细胞RNA的提取，这样DNA在酚相，RNA在水相。两者就分开了。2、Tris饱和酚。 一般PH大于7.8，用于DNA的提取和纯化。其制作过程如下： （1）冰箱取出重蒸酚，室温放置一会，然后放入68度水浴溶化，切 勿立即放入68度的水浴中，以防玻璃炸裂。（2）加8－羟基喹啉至0.1％和β－巯基乙醇至0.2％，混匀，溶液呈 现黄色，倒入分液漏斗中（也可在烧杯中进行）。（3）加入等体积的1M的Tris(pH8.0),反复混匀后，静至分层；放出 下层黄色酚液，弃上层。（4）加固体Tris约1g/100ml酚，摇匀，去水相。（5）加0.1M Tris(pH 8.0)平衡数次，至pH为8.0。（6）加0.1M Tris(pH 8.0)于棕色瓶中4度保存。 注意：无论重蒸酚、水饱和酚还是Tris饱和酚现在均可直接买到，不需自己制备。但不管哪种酚，如黄色消失或呈粉红色，则不能使用。 苯酚/氯仿/异戊醇为什么会分层？ 因为所用的Tris饱和酚中有水，而水难以与苯酚、氯仿或异戊醇混溶，所以会分成两层。 上层是水相，下面那层淡黄色的液体是苯酚/氯仿/异戊醇的混溶液。 DNase－free RNase储存溶液配制 溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的1 mM的乙酸钠水溶液中（pH 5.2）,使终浓度为10 mg／ml。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。然后在室温下