分子生物学实验操作方法与技巧3）课件.ppt

标准的限制酶酶切体系 一般是1μg底物DNA，在50 μl终反应体系中，用1个单位（1 Unit）的内切酶催化，在推荐的反应缓冲液和温度下反应1个小时。 酶解1μg以下或以上的DNA，可按上述标准体系进行缩小或放大。加入过量的内切酶，可以缩短反应时间并达到酶切完全的效果，但是不能过分加大酶的用量，以免产生星活性。所以我们推荐稍过量的酶（2-5倍）较长的反应时间。 对于绝大多数酶切反应，通常4-6小时都足以完全酶切反应底物。如果底物不纯或难以酶切，通常过夜酶切（8-12小时）可实现底物的完全酶切。但不推荐太长的酶切时间（18小时以上），太长的酶切时间（或许还有酶量过多的原因）有时会把反应底物切成碎片。 由于某些未知的原因，有时按预实验结果放大酶切体积的时候，会导致酶切效果不理想。如果重复一次实验仍然不能解决问题，这种情况下最好的办法是做多管小体积的酶切实验，最后把酶切产物汇集到一起进行电泳、回收酶切片段。 星活性（Star activity） 限制酶根据反应条件的不同，可能会切断与原来认识序列不同的位点，这种不同于原来的特异性的活性，称为星活性。一般产生星活性的主要原因是反应体系中酶量太多（一般不要超过15－20％），或样品中甘油含量多（一般不要超过10％），或酶切温度变化（如从37?C变为30 ?C ）。 双酶切反应 使用两种酶同时进行DNA切断反应，是实验操作中非常常用的手段。此时，使用Buffer非常重要。为了节省时间，通常希望在同一反应体系中进行。Takara采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表明了在各Universal buffer中的相对活性（详见Takara商品目录A－4表）。根据该表，可选出双酶切时的缓冲液（具体见Takara商品目录A－6表，选择原则是该缓冲液应该使两种酶的活性都比较高，且尽可能避免出现酶的星活性）。尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。此时应自己调整缓冲液的成份（ Takara商品目录A－5表，如先在低盐Buffer下用一种酶切，然后补加盐后，将一种酶加热失活，再在高盐Buffer下用另一种酶酶切。 根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶切位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能。此时可调节酶切反应体系或换不同的载体进行酶切反应。 PCR片段末端的限制酶酶切 克隆PCR产物的方法之一，是在PCR产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切后克隆至用相同酶切的载体中。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必须在酶切位点旁边加上2－3个保护碱基，以3个为最好，才能使所定的限制酶对其识别位点进行有效切断。 保护碱基不是随便设计的，不同的酶需要设计不同的保护碱基，以达到最佳酶切效果。如有需要，我这里有份NEB公司限制酶的保护碱基资料（pdf版），可供大家参考。 如果加上保护碱基仍然不能切开PCR产物，可将PCR产物克隆（利用PCR产物末端通常加A的特性连接到T载体上）到T载体上再切。 酶切片段的回收 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后将所需大小的酶切片段从胶上切下来，利用DNA胶回收试剂盒进行回收。具体技术细节和产品推荐将在电泳章节中详述。 限制酶末端的相互连接 尽管限制酶不同，但只要酶切后产生的切口序列相互吻合，就可相互连接。在Takara产品目录A41－A47中罗列了这些限制酶的相互关系，对选择用于切断－连接的限制酶很有用处。 同尾酶举例 BamHI 识别位点：GGATCC， BglII识别位点： AGATCT， BamHI切后产生：GATC末端 BglII切后产生：：GATC末端 所以二者的酶切产物可以互相连接起来，产生新的识别位点GGATCT，该序列能被MfII和Sau3AI识别。 限制性内切酶和连接酶品牌推荐 内切酶推荐品牌:Takara（宝生物），ToYoBo（东洋纺）。这两个公司生产的限制性内切酶价廉物美，非常可靠，适用于绝大多数酶切实验。如果重复多次酶切都不成功，且DNA质量和酶本身都没有问题，那么推荐可采用质量最好的限制性内切酶NEB （New England Biolabs）公司的酶试一试，通常都能立刻解决问题。 连接酶推荐品牌: 绝大多数连接实验都可采用Takara公司的 ligase或ToYoBo公司的Ligation high完成。如果酶切位点特别难连接或进行平端连接，推荐采用质量更可靠、连接效率更高的下列品牌的连接酶： NEB（New England Biolabs），Clonetech,德国宝灵曼的ligase(已被Roche收购)。 最近，加拿大的Fermentas（富酶泰斯）产品也开