分子生物学实验终稿课件.pptVIP

在分子水平上,根据人们的需要以人工的方法取得感兴趣的目的基因,在体外与载体DNA分子重组,然后将重组分子转入受体细胞,并筛选出能表达重组DNA的活细胞,加以纯化、扩增，成为克隆。 质粒DNA的提取和鉴定 碱裂解法抽提质粒DNA: 利用基因组DNA和质粒DNA变性和复性的差异来分离提取质粒。在pH高达12.6的条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但它的超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型。而染色体DNA不易复性而形成缠连的网状结构。 进一步用氯仿使蛋白质变性去除蛋白杂质，用无水乙醇沉淀质粒DNA，可得到纯化的质粒DNA。 Solution I 中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体。 Solution II要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入solution II后放置时间不要超过5min，以免变性质粒不易复性。 加入solution II后液体应由混浊变为透明粘稠，可见拉丝现象。若没有上述现象发生，则实验不能继续下去，应检查试剂配制及操作是否有误，然后重新开始。 质粒DNA提取过程中动作要轻柔，以免对DNA造成损伤。 为什么用无水乙醇沉淀DNA？ 这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。 DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。 琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA 琼脂糖凝胶分离范围 琼脂糖浓度% 线状DNA分子分离范围Kb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 上样缓冲液（6×）： * * 重组DNA技术 分子生物学实验技术 复 制 翻 译 转 录 不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接成新的DNA分子， 这一过程称为DNA重组。基因重组是自然界的一种常见现象， 是物种演变、生物进化的基础。 不同来源的DNA分子 重组DNA分子 基因重组 重组DNA技术 克隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。如细菌克隆、动物克隆和分子（DNA）克隆等。 Restriction enzymes: ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 选（分） 切 接 转→筛→扩 重组DNA技术的基本过程 其作用是： 携带目的基因DNA（或外源DNA)进入宿主细胞（大肠杆菌，哺乳动物细胞等）。 使外源DNA在宿主细胞复制扩增或表达。 载体的选择 常用载体：质粒DNA，噬菌体DNA，病毒DNA 1．能在宿主细胞中独立复制，并能携带重组DNA片段一同扩增； 2．有合适的限制性酶切位点便于进行克隆； 3．载体分子应尽量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制； 4．有一定的筛选标记，易于识别和筛选； 5．表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子、前导序列、增强子等调控元件； 6．生物安全性好。 载体的选择标准 insert BamHI replication 存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。 （1） 本实验应用的质粒 将菌液倒入1.5ml离心管中(尽量倒满) 12000rpm /30s (沉淀菌体)  ↓在原管中重复上述操作1次  弃上清扣干,加入预冷的solutionⅠ 100μL,剧烈振荡打散菌体, 冰浴5min  ↓（以下操作要轻柔） 加入新配制的solutionⅡ 200μL,温和颠倒离心管2～3次混匀，