免疫共沉淀步骤范例.doc

在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。 完成《WB实战指南》后，朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚；当时不得不回绝。因为，WB指南是基于这些年的回复的汇总，基本上方方面面的问题都有提及，只需要做些串联；而论及coIP，目前在国内还不太普及，尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。因此，再想写这么个长篇颇耗时间，于我的时间和精力太为难；不过，今天是个特殊的日子，凑凑热闹吧。——人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有亏欠，也许这就是上帝的公允吧。——在自己最擅长的地方找点成功的感觉吧，当然我的失败也只是因为没有更多的时间。。。哎！扯远了玩coIP也玩了5年多了，因为上手就是最难的B蛋白结合量多少的变化（假定IP A蛋白）而非检测B蛋白的有无，说句吹牛皮的话，在我们这个小领域三家最强的lab唯有我们敢于通篇基于这种检测手段，所以，对于coIP算是非常得有心得了。以下论述基于最难的B蛋白结合水平变化的检测，所以部分实验操作非常苛求；学会这个，其他就是小菜了；所以，这也算一个进阶篇。一.样品的制备。如《WB指南》，在这里我最强调从制备样品开始的一致性。如果不触及细胞的凋亡或死亡，那么任何处理组样品和ctrl最后的终体积应该保持一致；如果细胞有大量凋亡或死亡，可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定量后再加裂解液，一般可以把误差控制在WB的检出范围以下，基本保持样品的均一；组织样品可以通过称重添加相应体积比的裂解液。裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的，原配方如下：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors（0.5M PMSF)此裂解缓冲液裂解条件相对温和，适合后续的coIP分析。“不过”用它做coIP有明显的缺陷；要理解此配方的缺陷，我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪”。伪造结果，也分为单纯性造假和技术型伪造。撇去前者，从技巧上来讲，如果要想获得设定、预想的相互作用结果，可以从几个角度着手——此类结果可重复。a.在低盐离子裂解液中进行IP。很多蛋白复合体对盐浓度敏感，但敏感性有强弱之别。通常来说，真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐（0.15M）或更高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。具体如，某种CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高盐而不解体，即使其抑制蛋白CKI能耐受0.6M以上高盐。因此，了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受，既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据，更是一个非常重要的生化数据；对某些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。例如，纯化有生物活性的CDK和Cyclin，如果采用盐浓度漂洗，则最低需0.6M以上以解离CKI。所以，在生化领域的coIP分析中，很多实验体系的盐浓度是比生理盐浓度更高的。当然，不排除某些弱相互作用需要生理盐浓度，但这种情况不多见；也容易跟瞬时的相互作用混淆，某些实验中的弱相互作用实际是由于生化反应的瞬时性，且缺乏有效的截留、富集手段，诸如酶和底物。很多非生化领域的，喜欢在生理盐或更低盐浓度下进行coIP，这大大增加了假阳性的几率——很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。这也成为了获得“设定的”相互作用的有效手段。b.过表达。现在已经存世的相当多的实验论文和数据，其蛋白复合体相互作用的数据是通过过表达，甚至原核GST pulldown获得的；笔者认为，在阅读这类文献时，大家要特别小心，多长一个心眼——即始终抱怀疑的态度。并非说一定不可取，但是有一点很明确，这样的数据送到我们手里，首先我们会要求对方补充内源性蛋白相互作用的证据，否则该结果一律不采信。在《WB指南》里面我提过，血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别（其实也是一种相互作用），那么同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，为什么不可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用呢？因此，如果想要“特定”的相互作用，可以考虑过表达所有的蛋白，就是核蛋白结合胞浆蛋白甚至膜表面受体也不稀奇。c.不添加NP40一类表面活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗。NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高coIP的特异性。因此，减少或不添加NP40也可以辅助“预期”目的。实际上，掌握a、b