PCR的技术大攻略.docVIP

一、PCR技术及步骤 聚合酶链式反应（PCR）PCR扩增产物的克隆?上述两个实验包含基本原理、步骤、问题等。二、PCR常见问题汇总? 1. ?没有得到扩增产物?? （1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。?? （2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。?? （3）变性温度是否准确：PCR仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。?? （4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq酶以前，将反应体系95加热5-10分钟。?? （5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。?? （6）使用PCR试剂盒时还应注意：?? 是否严格按照说明书操作；?? 试剂使用前是否充分混匀；?? 试剂储存过久或不当而失效。?? 2. ?扩增产物在凝胶中涂布或成片状?? （1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。?? （2）dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。?? （3）MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。?? （4）循环次数过多；增加模板量减少循环次数，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR循环。?? （5）退火温度过低。?? （6）电泳体系有问题：?? 凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；?? 凝胶没有凝固好；?? 琼脂糖质量差。?? （7）若为PCR试剂盒则可能：??? 由于运输储存不当引起试剂盒失效；?? 试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。?? （8）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。?? 3. ?溴酚蓝前有区带（很宽）?? （1）模板量太低。增加模板DNA的用量。?? （2）循环次数太多。减少循环次数。?? （3）复性度偏低。提高复性温度。?? （4）预变性后没有立刻上机循环。?? （5）引物3端是否互补；重新设计合成较长的引物。?? （6）引物用量偏多。降低引物的使用量。?? 4. ?扩增产物出现多条带?? （1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。?? （2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。?? （3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。?? （4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的PCR扩增。?? （5）样品处理不当。?? （6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。?? （7）若为PCR试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。 5. ?PCR假阳性结果?? （1）引物设计不当，应调换引物。?? （2）循环参数不合适，导致非特异性扩增。?? （3）靶序列的交叉污染。 6. ?PCR假阴性结果?? （1）引物长度不够。?? （2）试剂浓度不标准。?? （3）靶序列如突变、缺失等。?? （4）循环参数设置错误。?? （5）标本中有Taq酶抑制剂。?? （6）PCR产物检测系统灵敏度不够。 三、PCR经验总结? 1. ?增加PCR的特异性?? （1）引物设计 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件：? a ?足够长，18-24 bp，以保证特异性.当然不是说越长越好，太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量；?? b ?GC% 40%~~~~60%；?? c ?5端和中间序列要多GC，以增加稳定性；?? d ?避免3端GC 富集， 最后3个BASE不要有GC，或者最后5个有3个不要是GC；?? e ?避免3端的互补，否则容易造成二聚体。?? f ?避免3端的错配；?? g ?避免内部形成二级结构；?? h ?附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5端,，在算Tm值时不需要加上这些序列，但在检测互补和二级结构是要加上它们；?? i ?需要使用兼并引物时，要参考密码子使用表,注意生物的偏好性，不要在3端使用兼并引物，并使用较高的引物浓度(1 uM-3 uM)；?? j ?最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al. * 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少