临床生物化学常用技术讲解.ppt

临床生物化学检验常用技术 第一节 光谱分析技术 光的本性 光的描述：波长和能量 可见光：400nm~760nm 紫外光:200 nm~400nm 红外光: 760nm~1000nm 光谱分析技术原理： 吸收曲线（Ａ－Ｃ曲线） 吸光系数的应用 １、定性 ２、判断方法的灵敏度 ３、定量测定物质浓度 偏离朗伯比耳定律的因素? 1、光学因素 2、化学因素 3、为什么有的分光光度计使用双波长或双光束？ 分光光度法的结构 光源及光源要求 波长的选择原则:可按“吸收最大，干扰最小”的原则进行。 2、单色器 3、比色杯及要求 4、检测器与显示器 分光光度计的使用 （二）分光光度技术的定量方法 1、对比法 1、将已知浓度的标准品和待测溶液有同一方法、在相同条件下同时进行测定。 2、当标准液与标本用量可能不同时的测定。 （二）分光光度技术的定量方法 2.标准曲线法 用途： 1、确定分析范围 2、减少系统误差 3、比较方法的灵敏度 作图法的步骤 1、制备标准液 2、显色反应 3、比色 4、作图 5、制作检量表。 第二节电化学分析技术 电位分析法基本原理 电位分析法是利用电极电位和浓度之间关系来确定物质含量的分析方法。电极电位由能斯特方程式确立。电极电位测定是通过构建原电池电动势，其中一个电极的电位随待测离子尝浓度改变而改变（指示电极）；另一电极电位不受试液影响（参比电极），通过测定原电池的电动势便可求得待测离子浓度。 Nernst方程。其方程式为： 一、离子选择电极法的原理 离子选择电极分析法（ion selective electrode，ISE）是利用电极电位和离子活度的关系来测定被测离子活度的一种电化学分析法。ISE法的核心是指示电极上带有对被测离子选择性响应的敏感膜，膜的一面与被测离子的溶液相接触、另一面则与电极内所充的一定活度的被测离子溶液和内参比电极接触，膜内外的离子活度的差异引起离子从高浓度向低浓度迁移，从而产生电位改变，其数值可在等电流的条件下测定。 离子选择性电极结构 ISE的特点 ①选择性好:多数情况下共存离子的干扰小，组成复杂的试样往往不需分离处理即可直接测定； ②灵敏度高：可达10-5～10-8mmol/L, 线性范围宽，Na+为10-6～10-1mmol/L，K+为3?10-5～1mol/L，氯为5?10-5～1mol/L，Ca++为3?10-5～1mol/L； ③溶血、脂血及黄疸不影响测定，对有色、浑浊溶液都可进行分析； ④设备简单，分析速度快，易于自动化，标本用量少，应用范围广。 离子选择电极分析方法1、标准曲线法2、标准比较法3、标准加入法（消除基质效应） 三、离子选择性电极法测定的影响因素 1．离子强度 2、温度 3、PH值 4、共存离子的干扰 Attention! 电解质分析仪一般要求24小时开机，目的是为了保持电极膜很好的水化，增加电极的稳定性。经常关仪器，使得电极膜干燥，会加速电极膜的失效和产生测定中的漂移。 仪器正常启动后，清洗管道，进行两点校准，每隔2小时自动单点校准。 每天用后进行电极保养，去除附在电极膜上的蛋白质。 第三节 干化学分析技术 一、干化学分析原理 1、反射光度法 Kubelka-Munk理论：光反射率与固相层的厚度、单位厚度的光吸收系数以及固相反应层的散射系数有关系，当固相层的厚度和固相反应层的散射系数固定时，光吸收系数与待测物的浓度成正比。 二、分析原理 （一）分析过程 1．样本扩散层　待测样品定量加到干片试剂，由展开层把样品均匀展开，并且阻挡固体物质如红细胞和大分子物质进入试剂层。 2、反射层 光漫射层，为光检测提供一个具有反射的背景。 3、清除剂层：清除血清中内源性干扰物 4．试剂层　样品中的水分成为干式试剂的溶剂，试剂与待测物质进行化学反应。试剂层的结构还能控制多步化学反应的反应次序。 支持层为一透明胶片，仅起支撑试剂干片的作用。 干化学分析技术的影响因素 仪器监测：标准灰色试剂条/校准条 校准频度：每6个月校准一次，质控经常做 质控物：用干化学分析仪生产厂家提供 干片试剂的储存与使用：0℃保存，平衡后用 工作环境与温度：15~30℃，湿度85% 第四节 电泳分析技术 一、电泳技术的原理及其影响因素 1． 原理：带电粒子在电场中的移动现象称为电泳(Electrophoresis)。带负电荷的粒子向电场的正极移动；带正电荷的粒子则向负极移动。各种物质由于所带净电荷的种类和数量不同，因而在电场中的迁移方向和速度不同。利用物质的这种性质可以对物质进行分离和鉴定。 2． 影响颗粒电泳迁移率的因素 3、 缓冲液 （1）缓冲溶质 性质稳定，缓冲容量大、电导低、离子移动好 （2）pH 影响分子电荷性质和电量