植物生理学实验解读.ppt

 三 实验步骤 (1)MDA的提取 取0.5g叶片剪碎，加10% TCA 2ml和少量石英砂，研磨，进一步加入3ml TCA充分研磨，匀浆液以4000r/min下离心10min，上清液即为提取液，定容至10ml。 (2)显色反应及测定 吸取上清液2ml，加2ml 0.6% TBA，混匀，在沸水浴中煮沸15min，迅速冷却，在4000r/min下离心5min 。取上清液测定532nm和450nm下的OD值。 对照以2ml TCA 代替提取液。 四 结果计算 以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155mmol-1cm-1消光系数计算MDA含量。 分别计算衰老和对照组的值。 MDA浓度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450 MDA含量(μmol/g FW)＝ D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。 五 注意事项 0.1-0.5％的三氯乙酸对MDA-TBA反应较合适，若高于此浓度，其反应液的非专一性吸收偏高； MDA-TBA显色反应的加热时间，最好控制沸水浴10-15min之间。时间太短或太长均会引起532nm下的光吸收值下降； 如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心。 低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充 Fe3+（最终浓度为0.5 nmol·L-1） 可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。 思考题 1. 通过丙二醛含量测定能够解决什么理论和实际问题？ 2. 说明膜脂过氧化作用的对植物的影响。 3. TBA为什么要溶解在三氯乙酸中？ 4. 为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？ 5. 丙二醛反应液为什么加热时间过长会影响测定结果？ 6. 如果可溶性糖含量影响丙二醛含量的测定，你有什么办法消除其影响？ 7. 植物正常叶片与低温冻害叶片相比丙二醛含量有什么变化，分析其原因。 过氧化物酶活性的测定 ——愈创木酚比色法 一、实验目的 1.学习比较植物根系或叶片过氧化物酶的制备方法 2.掌握过氧化物酶的反应原理及测定方法。 二、实验原理 什么是过氧化物酶? 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。 酶活力 表示酶量的多少不能像一般物质那样，用重量(g)或体积(ml)。因为酶是一种生物催化剂。酶的存在和含量多少应体现在催化能力大小，即用酶活力(活性)表示。 酶活力（酶活性）指酶催化某一特定化学反应的能力。催化能力强(大)，酶活力就高(大)，也表示酶量多。酶本身的重量不能说明酶的实际含量多少。同样重量的酶，酶活力可以不同，活力高，价值就大。 二、实验原理 酶促反应速度 酶活力具体用它所催化的某一化学反应的反应速度来表示，即在最适条件下(最适pH、最适T) 酶催化的反应速度愈快，酶活力就愈高。速度愈慢，酶的活力就愈低。所以测定酶的活力(实质上就是酶的定量)测定就是测定酶促反应的速度(用v表示) 。 酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物增加量来表示。单位：浓度/单位时间 常用产物增加量表示，因为它从无到有，变化明显。酶促反应随时间增加，产物增加。 二、实验原理 酶促反应的速度曲线 Vmax 时间 产物的生成量 斜率＝浓度/时间＝V 从图可知，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降。 引起下降的原因很多，如底物浓度降低，产物浓度增加而加速了逆反应的进行，产物对酶有抑制作用等。 因此研究酶反应速度以酶促反应的初速度为准，即酶促反应最初的一段时间，产物呈线性增加时的反应速度。具体指酶促反应速度曲线的斜率。即从原点对曲线作切线，求切线斜率( v ) = 浓度 / 时间 二、实验原理 测定原理 RH2+ H2O2→2H2O + R 在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。 三、实验材料 校园中任意一种植物根系或叶片 （正常和