3.3_NA_cloning_PCR_ligN2案例.ppt

3. PCR反应体系 * 一个标准的PCR反应体系（50~100 μl）： 50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl（pH=8.4） 100 μg/ml 明胶或牛血清白蛋白（BSA） 1.5 mmol/L MgCl2 2个引物，各0.25 μmol/L dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP 各200μmol/L 模板DNA（人基因组DNA） 0.1~1μg Taq DNA聚合酶 2 U * Predenaturation 94 ℃, 4 min Denaturation 94 ℃, 0.5 min Primer annealing 55 ℃, 0.5 min Extension 72 ℃, 1 min (30 cycles) Final extension 72 ℃, 10 min 4. PCR产物的鉴定 1) PCR产物的大小和限制酶谱分析 * ??????????? DNA扩增产物, 直接定序或经过克隆再定序. 2) 核苷酸序列分析 * 5. PCR产物的克隆 具A-尾的PCR产物: 纯化,连接T-vector,转化,筛选重组克隆; 鉴定(定序) 平端PCR产物: 直接与平端载体连接;或者对PCR产物加尾(A),然后进行A-T克隆. * Taq DNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌YT-1中分离纯化而得.该酶的分子量为63-68 kD 1) 无磷酸单酯酶、磷酸二酯酶以及单链外切酶活性，无内切酶活性，但具有依赖于聚合酶活性的5’ -3’外切酶活性, 无3’-5’外切酶活性. 2) 最适反应温度为80℃ 3) 最适pH8.0和最佳反缓冲液Tris·HCl 4) 最佳二价阳离子Mg2+ （10 mM） 5) 具良好的热稳定性：90℃下连续反应30分钟仍有70%的酶活 二. DNA聚合酶 1. Taq DNA聚合酶 * Taq DNA聚合酶的特性 * 当采用Taq DNA聚合酶进行DNA体外扩增时，必须考虑到以下五个参数： 1）热稳定性：在PCR循环中DNA的变性时间常为30-60″，若循环30次，其累计加热变性时间为15-30′。Taq DNA聚合酶在90℃下保温30′仍具有70%酶活性，可大大减少操作步骤，易于实现自动化 *2）模板与引物的特异性：当退火温度和DNA链延伸时温度偏低时，引物与模板配对的特异性大大降低，从而导致一些不需要的DNA片段被扩增。显然，其产物的专一性大大降低，使结果无法分析。由于Taq DNA聚合酶最适反应温度为80℃，退火温度可提高到55℃以上，由此大大减少了引物与模板的非专一性结合，使产物均一性大大增加 **3）合成产率：反应底物和产物在DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，平台期出现的时间与聚合酶的特性有关。研究表明，利用Klenow片段进行20次扩增后进入平台期，累积产物拷贝数为2×105，当采用Taq DNA聚合酶时，扩增25次后才进入平台期，拷贝数可大4×106 ***4）延伸长度：有时为了获取较长DNA片段的扩增，这就要求DNA聚合酶具有较强的延伸能力。当扩增片段大于250 bp时，Klenow片段和T4聚合酶扩增产率大大降低。利用T7 DNA聚合酶，可使扩增片段达2 Kb。当利用Taq DNA聚合酶时，最长延伸长度为4.4 Kb. 经改造的Taq DNA聚合酶可扩增出40 kb的DNA 片段. * 5）扩增产物的可靠性：评估DNA聚合酶的一个重要指标是它复制DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率。这对于PCR技术的可靠性是至关重要的。Klenow片段的错误掺入率为10-4，Taq DNA聚合酶的错误掺入率为5×10-3 ，而T4聚合酶的错误掺入率为10-7。 ?*注: 1）退火温度常与引物的长度和碱基组成有直接相关关系，引物越长或GC含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些。退火温度越高,引物与模板（即扩增的DNA）结合的特异性越高，这可大大减少非特异性DNA片段的扩增。 引物的长度常为20-28聚体，其中有50%以上的GC含量，无自身互补序列，特别是3末端不应有内部二级结构，引物加量为每100μl l20pmol. **2)出现平台期的原因可能有：①后期循环酶浓度或聚合时间不足；②引物耗尽；③dNTP耗尽；④产物浓度过高，以致ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。 ***3）链延伸长度与延伸时间有关，对于Taq DNA聚合酶，每分钟可形成2000 n.t.或更多。如果要