全柱成像毛细管等电聚焦电泳的应用讲解.ppt

某细胞因子及其PEG化的iCE-280结果 Non-PEGylated PEGylated Non-PEGylated Deamidation PEG化工艺（专一性）的不同 CIEF-WCID分离聚乙二醇化重组人生长激素 聚乙二醇化重组人生长激素是由仅仅修饰一个PEG，但存在5个位点的异构体。 IEC-HPLC分离聚乙二醇化重组人生长激素 小结 CIEF-WCID能适合分离因唾液酸差异的糖蛋白，分析其电荷异构体。 CIEF-WCID能适合分离PEG随机多修饰的蛋白 CIEF-WCID不适合分离PEG单一修饰的蛋白（等电点差异很小的） 非涂敷的毛细管EOF随pH变化极大, p H-tR 呈非线性,在 窄的p H范围内校正曲线为近似的直线。分析强碱 性蛋白或要保证较高的线性时,可采用流体动力学 或化学迁移方法;对p H只有较小差别的蛋白质来 说,采用化学迁移的方法可得到最高的分离度 * * * * 在 20 种构成蛋白质的常见氨基酸中， 只有具有极性的氨基酸残 基的侧链基团才能够进行化学修饰。 常用的反应氨基酸包括赖氨酸、 半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，N-端氨基和 C-端羧基。 成像毛细管等电聚焦技术的应用 翰宇药业 研发三部 李勇 毛细管等电聚焦电泳简介 毛细管等电聚焦( capillary isoelectric focusing，CIEF) 是指在毛细管中进行的等电聚焦。CIEF是根据物质的等电点( pI) 不同而进行分离的． 采用两性电解质混合物作为载体电解质，当在用溶质和两性电解质混合溶液充满的毛细管两端加电场时，带电的两性离子和蛋白质以不同的速度迁移通过介质，带正电的向负极迁移，带负电的向正极迁移，当它们迁移至pH = pI 的区带时，静电荷为零，不再迁移，这个过程称为等电聚焦． CIEF 是分析两性生物分子的强有力工具，具有分离时间短、分辨率高、进样量少等优点 传统CIEF的迁移方式 利用电渗流，一般采用采用动态涂敷或化学修饰的毛细管 改变阳极或阴极的电解质进行化学迁移，即对蛋白质首先进行聚焦,然后通过阳极加盐或采用碱性电解质(阳极迁移)、阴极加盐或把阴极电解质换为酸来进行(阴极迁移)。 流体动力学方法，一般采用重力或者加气压的方式 传统CIEF的问题 传统的CIEF 使用单点检测器，即使所有样品在到达检测器前已经完成分离，也要等到所有聚焦区带都通过检测器后才能结束分离检测． 从形成pH 梯度到样品聚焦完成通常只需要5 min，而聚焦区带依次通过检测器却需要10 ～ 40 min，不仅增加了额外的分析时间，并且移动过程会导致分离谱带展宽而影响分离度和分辨率，还可能导致蛋白质沉淀。 成像毛细管等电聚焦优势 全柱成像检测( whole column imaging detection，WCID) 克服了传统CIEF 的不足，采用一个动态检测器如电荷耦合装置( CCD) 照相机或光二极管阵列( PDA) 对整个分离毛细管柱( 5 cm 或更短)进行实时检测． 整个毛细管内不同时间与不同位置上发生的任何事件均能得到检测． WCID 不仅能对样品进行常规的分离分析，还能在分离的同时提取出有关动态过程的动力学参数，从而获取多重信息． 因此，CIEF － WCID 技术在生物样品的分离分析、蛋白质组学的研究中有着广泛的应用前景． 因此CIEF － WCID对比传统的CIEF优势在： 不需要迁移 分析时间快 重复性好 能够实时监控 iCE-280的结构图 280nm UV cIEF without MobilizationThe iCE280 iCE-280的结构图 CIEF-WCID在抗体方面的应用 羧肽酶去除C 末端赖氨酸后，继续分析其电荷异质性， 结果如图B 所示。抗体1主峰后的2 个碱性峰均消失，证明这2 个碱性峰为C 末端赖氨酸不均一性所引起 CIEF-WCID在抗体方面的应用 为判断末端赖氨酸不均一性对其电荷异质性的贡献，将抗体2 用羧肽酶 去除C 末端赖氨酸后，分析其电荷异质性，结果如图 B 所示。抗体2 主峰后的2 个碱性峰均消失，证明这2 个碱性峰为C 末端赖氨酸不均一性所引起。但是经羧肽酶B酶切后，其主峰前仍有2 个比例较高的酸性峰，为判断唾液酸修饰对其电荷异质性的贡献，将羧肽酶酶切后的抗体2 继续用N － 糖苷酶酶切，分析其电荷异质性，结果图 C 所示，经过2 个酶切处理后，抗体2 的图谱基本上只剩1 个主峰，证明抗体2的电荷异质性主要是有C 末端赖氨酸的不均一性和唾液酸修饰所引起。 CIEF-WCID在抗体方面的应用 由于单抗的分子量巨大，在生产及储存过程中可产生大量的修饰，如糖基化、N 末端的焦谷氨酸化、C 末端的赖氨酸截除、氧化、脱酰胺等等，理论上这