水稻瘤矮病毒部分基因组片段克隆及序列解读.ppt

水稻瘤矮病毒部分基因组片段的克隆及序列分析 研 究 生: 范 国 成 指导教师：吴祖建副研究员 研究概况--传统生物学 分类地位 水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus, RGDV）属于呼肠孤病毒科植物呼肠孤病毒属的成员之一。与三叶草伤瘤病毒（Wound tumor virus, WTV）、水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus, RDV）和水稻簇矮病毒(Rice bunchy stunt virus, RBSV)同属一类病毒。 分布 1980年首次泰国发现，随后马来西亚、日本、韩国和中国的广东、广西也有报道。福建的云霄、诏安已有零星分布。 研究概况--传统生物学 危害 广东省信宜市发病率一般在1%-5%，重者30%以上，水稻严重减产。重病田减产4500公斤/公顷，甚至失收。 研究概况--传统生物学 病毒粒体 呈三重对称的二十面体结构，直径大约65nm--70nm。 病毒粒体在水稻和昆虫介体中的定位 研究概况--传统生物学 血清学 研究概况--传统生物学 发病规律及防治措施 主要为害晚稻，尤以杂优稻受害重；早稻受害较轻，是晚稻的主要侵染源。晚稻播种后从秧针期开始即受侵染，早播早植比迟播迟植发病重，9叶龄后感染的不发病。 控制初侵染源和杀灭传毒介体。 研究概况--分子生物学 基因组包含12条线形超螺旋双链RNA片段，总分子量大约1.428×107或1.692×107。 反向重复序列 研究概况--分子生物学 本项目研究的目的及意义 理论意义 1. 国外只完成RGDV-T部分基因组片段的序列测 定及功能分析，许多基因功能尚未明确；国内RGDV的分子生物学方面还属空白。 2. RGDV界于RDV与WTV之间，且既能在寄主植物又能在介体昆虫的组织或细胞中复制，是研究植物呼肠孤病毒属病毒的起源与进化以及病毒—介体—宿主之间关系的模式对象。 本项目研究的目的及意义 现实意义 病区发病重，有进一步蔓延趋势，对南方稻区具有潜在危害，因此有必要对其基因组结构及功能进行研究。 材料与方法（一） RGDV中国广东信宜分离物（RGDV-C）采自广东省信宜市感病的水稻（2002年9月），采集的病株种植于防虫网室，病叶保存在-70℃冰箱中 其他试验材料 材料与方法（二） CF-11纤维素柱 RT-PCR 单引物扩增技术 分析软件 材料与方法（三） 克隆策略 材料与方法（四） 单引物扩增技术路线 结果与分析--提取纯化 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 M 1 2 3 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 结果与分析--同源克隆 结果与分析--新基因扩增 1.单引物技术扩增S12片段 结果与分析--新基因扩增 结果与分析--新基因扩增 3. 编码特性 结果与分析--系统进化 1. 外层衣壳蛋白系统发育分析 结果与分析--系统进化 2. RGDV-Pns10系统发育分析 结果与分析--系统进化 3. RGDV-Pns11系统发育分析 讨论 1.单引物扩增技术与新基因组片段的扩增 应用于扩增无末端序列信息的dsRNA病毒基因组片段的新方法。 扩增大约1kb的片段，由于RGDV几个未知基因组片段都较大，还需要对实验条件和实验方法加以优化改进特别是PCR扩增时的循环数，第一条引物与dsRNA 3’端的连接条件以及RAN的降解和双链cDNA的复性补平等都有待于摸索。 讨论 2.基因组末端序列和反向重复序列 所有测定的植物呼肠孤病毒基因组片段中都存在属特异性的末端保守序列和反向重复序列，在基因组片段包装时，前者充当区别病毒和宿主基因组的信号，后者充当挑拣每条病毒自身基因组片段的信号。 讨论 3.保守结构域 由Pns11同源蛋白组成的蛋白家族具有共同的保守域，其功能尚不清楚。但是，这一家族与抗菌素整合酶家族（Phage integrase family）还具有一部分相同的保守结构域，具有该保守结构域的抗菌素整合酶家族成员具有核酸结合活性。 讨论 4. 系统进化 RGDV在属内以外层衣壳蛋白和两种非结构蛋白进行系统发育分析时所得出的结论并不一致，甚至相互矛盾。如果结合致瘤特