代谢调节与代谢工程3.讲解.ppt

* 添加mg2+提高了酶的活性，使整体流量增加了近1倍，然而分配进入1，6-二磷酸果糖的流量却增加不多,胞外1，6-二磷酸果糖的累积量也中是由7.3增加到16.1. 结论：葡萄糖-6-磷酸节点非刚性. * 设计两组试验：添加EDTA，添加EDTA的作用：可以降低1,6-二磷酸果糖的降解速率和减少葡萄糖的吸收速率; 添加NH4Cl解除ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用，增加1,6-二磷酸果糖的量，从而刺激磷酸解酮酶的活性，增加ATP的合成. * (2)扩展代谢途径 在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。 (3)转移或构建新的代谢途 通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。 * 三、代谢工程发展趋势 传统的代谢工程是以代谢网络理论为基础，以代谢分析和代谢改造为主要手段。代谢途径的复杂性给检测分析带来不少麻 年代末兴起的逆世纪烦，在某种程度上阻碍了它的应用。 逆代谢工程 限制活性 的因素 鉴别表型 基因 菌种改造 * 代谢工程有关术语 (1) 途径是指催化总的代谢物的转化、信息传递和其他细胞功能的酶促反应的集合。 (2)代谢网络:分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送体系的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包括物质代谢网络和能量代谢网络。 (3) 通量: 物质或信息通过途径被加工的速率。 * (4) 代谢主流：在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该条件下的代谢主流。 代谢途径的延伸和剪接都可能改变代谢主流，从而实现新基质的利用和新产品的开发。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成部分。 (5) 载流途径：代谢主流流经的代谢途径为主要载流途径，简称载流途径。在代谢工程领域，是指碳流在代谢网络中通过的主要途径，即生产所需产物期间让碳流相对集中流向产物合成的途径。 * (7) 代谢主流的变动性和选择性：微生物的代谢主流处于不断变化之中，其方向、流量甚至代谢主流的载流途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的变动性和代谢主流对代谢网络途径的选择性。这种变动和选择的根据在于微生物细胞的遗传物质，选择的原因是微生物所处的环境条件的变化。 * 2 代谢物流及相关特性 (1) 代谢物流与酶的关系 代谢反应的速率与细胞内酶和代谢物的浓度有关。在代谢工程中把酶促反应看成是代谢系统的基本组成，而把基因、酶的水平、代谢物浓度、抵制机制、效应物、抑制剂、激活剂、环境条件等的影响看成是对酶促反应的扰动。 因此，可以结合酶的反应动力学性质描述代谢网络特性。 * X A C B JA JB JC SB SC SA 具有一个分支点的简单代谢途径 * Cx=C1时， X浓度变化对反应B、C速率无响应； Cx=C3时，反应B、C速率对X浓度变化的响应相同 此上两种现象即称X处的分支点为刚性节点。 CX=C2时，X浓度微小变化将对B、C反应速率造成不同的影响，VA与VB+VC交点处的浓度称为稳态浓度。 X浓度 VB+VC 稳态浓度 * 结论： 典型的物流与酶量之间的关系大致呈双曲线形。 * (2) 物流限制作用的克服 代谢途径存在着固有的限速步骤，它们控制着流经代谢途径的代谢物流，其主要特征表现在： ①限速步骤的反应速度很低，整个系统的代谢物流取决于催化该反应步骤的酶活性； ②限速步骤直接受制于该步骤酶活性和酶蛋白合成的调节。 调节方法： (a) 等量提高所有酶的量； (b) 提高限速酶的量。 鉴别出具有高的流量控制系数的酶比超表达个别酶往往能获得更好的结果。 * (3) 反馈抑制与限制流 在代谢改造过程中，利用色氨酸类似物——5-甲基色氨酸分离抗色氨酸突变株，有利于色氨酸的生产。 色氨酸合成途径 反馈抑制 * 反馈抑制的特征 ①只有代谢的终产物或它的结构类似物具有反馈抑制作用； ②受抑制的一般是代谢途径的第一个酶； ③反馈抑制作用是可逆的。 由于这种抑制作用的可逆性，所以细胞才具有调节代谢的作用。 * 消除反馈抑制作用的主要效果在于增加代谢中间体的浓度，而对物流的影响很小。 超表达单个酶不能增加代谢物流。 大量研究结果表明，物流的控制分布在多个酶上，在任何情况下解除单个酶的反馈抑制作用是有限的，特别是在途径起点受反馈抑制的酶是物流控制不敏感之处，尽管它对代谢物的浓度有很大的影响。想通过单个酶来提高代谢途径的物流是行不通的