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第二章 高效液相色谱法 第一节 概述 第二节 高效液相色谱仪 第三节 反相色谱 第四节 色谱条件的选择 第五节 系统适用性试验 超高效液相色谱（UPLC） 借助了HPLC的理论及原理，集新型耐压小颗粒填料、新型超高压输液泵、低系统体积及高速检测器等为一体的一项新技术 根据Van Deemter方程：H=A+B/μ+Cμ 其中A,C与填料颗粒度(dp)有关,A∝dp,C∝(dp)2 因而van Deemter方程式可表达为： H=a(dp)+b/μ+c(dp)2μ 显示固定相颗粒度对色谱柱性能的重要影响 不同颗粒度的Van Deemter曲线图 颗粒度越小柱效越高，特别是流动相在高线速度时，色谱柱也有较高的效率 不同的颗粒度有各自最佳的流动相线速度 更小的颗粒度使最高柱效点向更高线速度方向移动，而且有更宽的线速度范围 当填料的颗粒度低于2 μm时，不仅柱效更高，而且随着流速的提高，在更宽的线速度范围内不会使柱效降低 自动进样瓶、垫、盖 一些新的反相色谱固定相 中药专用柱 岛津-GL 公司新推出了专门针对国内中药用户开发的WondaSil C18柱 分离不同分子量蛋白推荐的色谱柱 色谱柱的使用与维护 所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积20～30倍的含低有机溶剂（10%）的水冲洗色谱柱 色谱柱 柱体积 冲洗体积 150× 4.6mm 2.5ml 50ml 200× 4.6mm 3.3ml 65ml 250× 4.6mm 4.2ml 80ml 2010版ChP 方法 柱温40℃ 流动相A——pH2.2的缓冲液-乙腈（85?15） 流动相B——乙腈 梯度洗脱 检测波长293nm（其他杂质），238nm（杂质羧酸） 二、检测器选择 根据样品性质、浓度；分离情况；测定目的进行选择 有紫外吸收——紫外-可见检测器 无紫外吸收或末端吸收——紫外-可见（流动相宜用乙腈系统）/蒸发光散射（灵敏度低） 具有荧光——荧光检测器（灵敏、专属） 具有氧化还原——电化学检测器（注意电极不同使用对象不同，常用电极有石墨电极、金指示电极-Ag/AgCl参比电极） 浓度低、峰难分离——质谱检测器 鉴别峰、判断纯度、确定波长——二极管阵列(灵敏度低） 三、色谱柱的选择 根据样品性质、分离情况、流动相pH等进行选择 极性大的水溶性成分——在一般ODS柱上无保留，出峰快，可采用： 用氨基柱、氰基柱等进行分析，流动相仍采用甲醇-水或乙腈-水系统； 选择新型固定相柱； 采用反相离子对色谱； 采用正相色谱——硅胶柱； 耐用性考察 样品溶液的稳定性 有些样品在流动相条件下不稳定，放置后会产生杂质峰，应注意。 例如有一样品在流动相溶液中不稳定，配制后于不同时间进样，发现在主峰后会产生一杂质峰，该杂峰随时间而迅速增大。 将流动相中缓冲液换成水后，样品测定液放置15h后仍稳定。 进样量对色谱峰分离影响 主动阀故障对色谱分离影响 主动阀阀芯出问题时，压力线会有不正常的压力降，或者是压力线波动很大，超过正负2-3个bar 导致进样后，各组分出峰忽而正常，忽而异常，且峰位置发生明显变化 更换主动阀阀芯，可消除上述症状 主动阀故障对色谱分离影响 第五节 系统适用性试验（药典要求） 通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数： 理论板数 n＝16(tR/W)2 或 n＝5.54(tR/Wh/2)2 不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，计算n时应指明测定物质。当测定结果有异议时，应以峰宽（W）计算结果为准。 系统适用性试验内容 分离度（R）一般应大于1.5 拖尾因子 （峰高定量时 T=0.95～1.05） 重复性 RSD不大于2.0％ 药典规定的色谱条件允许改变的范围 为达到药典规定的系统适用性试验要求，可适当改变色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量或检测器的灵敏度 但不得改变固定相种类、流动相组分、检测器类型 2010年版中国药典对流动相组分比例调整的新规定 调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（≤50%）相对于自身的改变量不超过?30%，且相对于总量的改变量不超过?10%为限，如30%相对改变量的数值超过总量的10%时，则改变量以总量的?10%为限。 思考题 中国药典对 HPLC的系统适用性试验要求包括哪些内容？ 什么是键合相色谱？一般化学键合相使用pH范围是多少？ 在反相色谱中影响物质分离分析的主要因素有哪些？ 在HPLC色谱条件选择中，如何快速地找到较合适的流动相组成及比例？ 说明反相离子对