8DNA序列测定.ppt

第八章 DNA序列测定 自然界中物种(生物)的丰富多样性是由其生命本质决定的，物种的本质特征的多样性首先体现在其DNA序列的多样性(病毒为RNA)，这种千差万别的DNA序列正是自然界中形态和功能各异的物种的基石。我们要了解各物种的本质特征，就必需从其DNA的一级结构上开始。因为其DNA的一级结构是各物种生理功能的基础，也是我们对其进行深入研究的出发点。 1977年，Sanger在加减法基础上提出了双脱氧末端终止法测序，其原理如下： 四个反应管中，在DNA聚合酶催化下，以单链DNA为模板，加入单引物、四种dNTP，以及每管中加入双脱氧核糖核苷酸ddA、ddT、ddG、ddC。双脱氧核苷酸(ddNTP)的5’端-OH是正常的，而其3’端-OH则没有，因此能与引物延伸链的3’端连接，而不能连接其后继核苷酸，于是引物链的延伸至此结束，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，根据电泳图谱即可拼出所测DNA序列（即DNA的核苷酸顺序）。 末端终止法测序步骤 一.测序DNA模板制备 二.四种反应液的准备 三.引物与模板退火 四.延伸反应 五.电泳 六.读序 DNA测序方法 末端终止法：最常用。 化学裂解法：研究DNA的二级结构，与蛋白质的相互作用。 杂交测序法：DNA多态性分析。 一. 测序模板的制备 测序可分为单链测序与双链测序，对于未知序列可采用单链测序，而对于已知DNA序列可采用双链测序。但不管单链测序还是双链测序，其测序反应都一样。 其中单链模板可通过将待测DNA片段克隆到噬菌体M13中或通过不对称PCR制备 ；双链模板可通过将待测DNA片段克隆到质粒DNA中或通过PCR扩增制备。所得模板DNA应通过纯化处理才能用于后继测序反应。 二. 测序引物的设计 测序所用引物一般采用通用引物，也可根据已有序列设计引物，引物一般有15～30个碱基，应遵循一般引物设计原则。 引物设计原则： 1、G+C含量为45～55%。 2、3端最好以A或C结尾，不要以T结尾。 3、引物长度以15～30bp为宜。 4、引物本身不能形成二级结构。 三. 四种测序反应液的制备 测序反应液组成：反应缓冲液、DNA聚合酶、Mgcl2、引物、纯水、四种dNTP，分别在四个反应管中加入一种相应ddNTP。 标记物：测序反应的标记物有核素和荧光染料。标记载体有引物、dNTP、ddNTP。 现在应用较多的是将荧光染料标记于引物或ddNTP上，因核素对环境的污染而逐渐应用得比较少。但也可以不进行标记而采用银染系统检测。 四. 延伸反应 引物在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补配对原则逐步在引物的3’端加上四种脱氧核糖核苷酸。 四个反应管中的ddNTP随机地与dNTP竟争结合位点，于是引物延伸链随机终止在各个可能位点，形成一系列相差一个核苷酸的单链DNA分子。 五.电泳与读序 反应产物与甲酰胺混和，并高温加热变性后，于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 对于没有标记的测序反应，电泳完成后可用银染将DNA标记、拍照、读序。 对于用核素标记的测序反应，按核素操作规程拍照。 对于用荧光染料标记的测序反应，现有一些商业生物技术公司开发的测序仪可在电泳过程中进行检测。 末端终止法图示 化 学 裂 解 法 首先对待测DNA单链单侧末端进行放射性标记，再分成4～5个反应体系，分别用不同的化学试剂处理，DNA片段分别于某一种或某一类碱基处断裂，而断裂的碱基随机发生于DNA片段上某种或某类碱基中的任何一个,且每一个DNA分子只有一处断裂点。电泳后，放射自显影得到相互错落的梯形图谱，即可读出DNA序列。 化学测序反应机理 G反应：硫酸二甲脂(DMS)使鸟嘌呤N7甲基化。 A+G反应：甲酸使嘌呤环的氮质子化而使糖苷键被削弱，进而嘌呤环被吡啶取代。 C+T反应：肼裂解嘧啶环，导致其脱落。 C反应：在一定浓度的NaCl存在时，肼只对胞嘧啶起作用。 以上反应完成后，吡啶在加热条件下导致被修饰碱基处磷酸二酯键断裂。 化学测序法操作步骤 1.待测单链DNA的纯化和标记 2.碱基的特异性修饰 3.碱基的裂解 4.上样电泳 5.测序图谱识读 化学裂解法的特点 优点： 1、所测序列直接来源于所测DNA，避免了DNA复制中错误dNTP的掺入。 2、可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲基化修饰等，以及研究DNA的二级结构及蛋白质与DNA的相互作用等。 缺点：操作复杂，读序困难。 杂 交 测 序 杂交测序是以基因芯片为基础的一种测序方法，将一段DNA片段分解为一系列相差一个碱基的八聚体，将这些八聚体做成基因芯片与待测DNA杂交，根据杂交结果拼凑出所测DNA序列。 杂交测序详解 TCACG