实用细胞培养技术概要.ppt

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实用细胞培养技术概要

实用细胞培养技术 ◆ 在细胞培养中注意的一些问题 ◆ 细胞培养的实验程序 ◆ 细胞的复苏 ◆ 细胞的计数 ◆ 细胞(贴壁)的传代培养? ◆ 细胞的冻存 ◆ 悬浮细胞的培养方法 在细胞培养中注意的一些问题 环 境 由于体外培养细胞没有抗感染能力,若实验者粗心大意,技术操作不规范,也会导致污染。因而,每一项工作都必须做到有条不紊和完全可靠,特别是实验环境更为重要。 ★ 超净工作台 台面每次实验前要用 75%酒精擦洗,然后紫外线消毒30 min。消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置,否则会遮挡射线,降低消毒效果。一些操作用具如移液器、废液缸。污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线照射消毒。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线。 2. 培养前准备 在开始实验前要制定好详细的实验计划和操作程序,有关数据的计算要事先做好。根据实验要求,准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置到培养室、超净台内,然后开始消毒。这样可以避免开始实验后,因物品不全往返拿取而增加污染机会。 3. 培养条件 ★ 气体环境:95%空气加5%CO2混和气体 环境中。 ★ PH值:7.2~7.4 ★ 温度:37℃ 培养实验用品的前期处理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿:新的玻璃器皿在生产过程中常使玻璃表面呈碱性,并带有一些如铅和砷等对细胞有毒的物质,使用前必须彻底清洗。首先用自来水初步刷洗,5%稀盐酸溶液中浸泡过夜。然后用流水彻底冲洗3-5遍,单蒸馏水漂洗3遍,三(双)蒸水漂洗2遍,烘干备用。 拧松一些,放入铝盒内(或用牛皮纸包装)外层用纸包装备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧;胶塞的处理:按常规冲洗干净烘干后,用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞要置入单蒸水中浸泡,再用沸水处理30钟),自来水洗净,烘干然后再泡入1%稀盐酸液中30分钟,用自来水彻底冲洗3-5遍,蒸馏水漂洗3遍,三(双)蒸漂洗2遍,烘干备用。 2.包装: 在消毒前必须进行严格包装,以便消毒及储存,防止落入灰尘及消毒后再次被污染。包装纸(盒)表面用油性记号笔标明物品名称、消毒日期等。 (1)消毒灭菌的方法 : ★ 物理方法: 湿热(高压蒸汽)、干热、紫外线照射线、过滤、离心沉淀等方法杀灭或去除微生物. ★ 化学方法:使用化学消毒剂、抗菌素等杀灭微生物。 (2)消毒灭菌的时间: ★ 干热消毒:一般在烤箱中进行,需加温到 160℃,保持90~120 min方能杀死芽孢。消毒完毕后不可马上将烤箱门打开,以免冷空气突然进入,影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外事故。 ◆ 一般物品:布类、金属器械、玻璃器皿等消毒的要求是 15磅20 min;常规使用液体:消毒 15磅 15 min 。橡胶和塑料用品 :如滤器、EP管、离心管等高压10磅15 min。 ★ 紫外线消毒:主要用于实验室房间里的空气、操作 台表面及桌椅等消毒。时间为30min-2h左右。 ★ 过滤除菌消毒:适用于组织细胞培养使用的液体 如血清、合成培养液、酶及含有蛋白质具有生物活性的液体等。 ★ EDTA液:常用浓度为 0.02%,配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解,高压灭菌后即可使用。 ★ 胰蛋白酶EDTA-Na2:需过滤除菌。胰蛋白酶和EDTANa2联合使用可提高消化率,但需注意EDTA不能被血清中和,消化后要彻底清洗,否则细胞易脱壁。 ★ 胶原酶:适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织,可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。可用BSS或含血清的培养液配制,这样实验操作简便同时提高细胞成活率。 但胶原酶价格较高,大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为 200 U/ml(约为 lmg/ml)或 0.03%~0.3%。 (4)培养基(液)过滤除菌 常用0.22pm微孔滤膜。 (8)3% L-谷氨酰胺:可作为细胞能量来源,使用量1%。但其在溶液中极不稳定,需重新加入。 (9)丙酮酸钠、葡萄糖:是属碳水化合物的成分,是细胞生命的能量来源。 (10)抗生素:最终浓度为青霉素 100 U/ml,链霉素100U/ml(青霉素为80万U/瓶,将其溶解于4ml三蒸水中,每升培养液中加入0.5ml;链霉素为100万U/瓶,将其溶解在5ml三蒸水中,每升培养液加0.5ml)。 (11)细胞生长液:是用以维持细胞生长增殖的液体。其是配方: 基础培养基 80%~90% 血清 10%~20% 双抗

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