实验三琼脂糖凝胶电泳概要.pptx

实验二、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是分子克隆的核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA片段。凝胶中DNA的位置可以用低浓度的荧光插入染料染色直接观察。 1、学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法 2、检测质粒DNA的纯度、浓度和分子量 一、实验目的 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。（GoldviewI的原理可能类似） 质粒DNA有环状超螺旋、开环、和线性三种构型，电泳时其迁移率各不同(超螺旋 线性 开环)。 二、实验原理 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围 1、0.8%：500bp-15kb 2、1.0%：250bp-12kb 3、 1.2%：150bp-6kb 4、 1.5%： 80bp-4kb 注意：高电压影响凝胶的分离范围，使分辨率下降！ 上次实验提取的质粒 pSK（3 kb） 和MP3 （6 kb） 三、实验材料 关于质粒大小在电泳中的鉴定：酶切后线性化条带电泳时所处的位置指示质粒的大小。 该质粒载体用的是pUC的复制子，拷贝数能达到500-700个。 四、仪器设备 五、实验用具 微波炉 电泳仪 微型电泳槽 紫外透射检测仪 凝胶成像仪 移液器 吸管头若干 加样板 量筒100 ml?1 三角瓶500 ml?1 六、试剂 琼脂糖 5?TBE电泳缓冲液 10 ? 载样缓冲液 （loading buffer） GoldView I型核酸染色剂 （10000 ? ） DNA分子量标准（DNA marker）：Marker III 10 ? 载样缓冲液：10 mM EDTA，0.25%溴酚蓝，50%蔗糖 七、实验步骤 （一）制胶（1% agarose gel） （二）点样 （三）电泳 （四）观察 1、称取1 g琼脂糖加入盛有100 ml 0.5?TBE电泳缓冲液的250 ml三角瓶中，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。在微波炉上加热至琼脂糖完全溶解，放在天平上加蒸馏水至原重量。冷却到约60℃后，加入10 ?l的Goldview I，并摇匀。 2、将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入制胶模具中，直至厚度为4-6 mm，插入适当的梳子，在室温下冷却凝固。 3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。将凝胶置入电泳槽中，加0.5?TBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm。 （一）制胶 （二）点样 用微量取液器（P20）吸取质粒DNA样品2 ?l于点样板小孔中，再加入8 ?l TE及1 ?l的载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔，蓝色样品混合物将沉入点样孔下部。同时点5 ?l MarkerⅢ作为分子量标准。 打开电源开关，调节电压至3-5 V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约一小时后即可观察。 （三）电泳 （四）观察 将电泳好的凝胶置于紫外透射检测仪上，戴上防护观察罩，打开紫外灯，可见到绿色核酸条带，根据条带粗细和荧光强度，可粗略估计该样品DNA的浓度。同时根据已知分子量的标准DNA，通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。 1、用微波炉煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出。 2、煮好的胶应冷却至50℃左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会。 3、倒胶注意厚度(4-6 mm)，充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。也可待胶稍凝固后，放入4℃冰箱10分钟，以加速胶的凝固。 4、加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型不整齐。 5、一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液（正极）洗几次即可再点下一个样品。 6、 凝胶中含有GoldViewI，切勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。 注意事项 常用电泳缓冲液配方 TAE是Tris-乙酸，缓冲容量小，但是溶解度大，易于储存； TBE是Tris-硼酸，缓冲容量大，但是溶解度小，不易长期储存，易产生沉淀； 分离大片段最好用TAE，小片段用