04_基因工程的主要技术及其原理概论.ppt

一、琼脂糖凝胶电泳 染色 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。 然后，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。 一、琼脂糖凝胶电泳 染色-凝胶的EB染色 注意事项 EB被认为是一种强致癌物质 EB可用来检测单链或双链核酸 EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。 当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。 一、琼脂糖凝胶电泳 染色-凝胶SYBR Gold的染色 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。 一、琼脂糖凝胶电泳 电泳的基本原理 一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的净电荷数量越多,其迁移的速度越快,反之则较慢。 电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳迁移率。 一、琼脂糖凝胶电泳 电泳的基本原理 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。 具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。 一、琼脂糖凝胶电泳 电泳的基本原理 标准分子：质粒DNA样品用单一切点的酶切后与已知相对分子质量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可获知该样品的相对分子质量大小。 凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的DNA，也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。 一、琼脂糖凝胶电泳 电泳的基本原理 在制备琼脂糖凝胶时加入溴化乙锭指示剂，溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍。荧光的强度正比于DNA的含量。如用肉眼观察，可检测到0.01～0.1μg的DNA。 一、琼脂糖凝胶电泳 一、琼脂糖凝胶电泳 一、琼脂糖凝胶电泳 影响电泳迁移的主要因素 DNA的大小：双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比 DNA的构象：一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状。 琼脂糖浓度：浓度越低，相同核酸分子迁移越快 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭：溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。 不同构像质粒 一、琼脂糖凝胶电泳 影响电泳迁移的主要因素 所用的电压： 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 电泳缓冲液： 常用的有TAE、TPE及TBE 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖； 二、琼脂糖变性胶电泳 主要用于RAN 的分离检测。 RNA分子是以单链形式存在的，但在局部仍有双链结构形成。由于这种局部双链结构的干扰，使得在非变性凝胶上对RNA分子完整性的鉴定及其分子量大小的检测，变得不十分可靠。通过加入乙二醛一二甲基亚砜、氢氧化甲基汞、甲醛等变性剂进行变性处理，使其局部双链变为单链。再进行电泳，RNA的泳动距离与其片段大小的对数值就形成良好的线性关系，从而可对RNA的分子大小及完整性程度作准确的分析。 琼脂糖凝胶电泳操作视频.flv 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE 聚丙烯酰胺主要由丙烯酰胺和N，N′-甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这两种成分在有引发剂和增速剂存在的情况下，丙烯酰胺的单体形成长链，由N，N′-甲叉双丙烯酰胺的双功能基团和链末端的自由功能基团反应而发生交联。 丙烯酰胺为白色结晶粉末，无味，分子量为71.08，为中枢神经毒物。N，N’-甲叉双丙烯酰胺也为白色结晶粉末，无味，分子量为154.17，亦为中枢神经毒物。1%的稀溶液与皮肤接触也会引起皮肤发炎，小鼠的确切致死量（LD50）为170mg/㎏，所以在实验室操作时应尽量避免与之直接接触和吸入粉尘。 聚丙烯酰胺凝胶中常用的引发剂过硫酸铵和核黄素在碱性条件下可产生自由基，而增速剂N，N，N′，N′-四甲基乙二铵（TEMED）可催化由过硫酸铵产生的自由基的形成，从而加速聚