08-3h-定点突变与基因打靶技术(李冬民)概论.ppt

由于在真核细胞内发生同源重组的机率非常低，因此要把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来，就成了基因打靶要解决的关键技术问题。 基因打靶筛选系统 1. 正向选择法： 正向选择法只适用于在靶细胞中能正常表达的基因。其原理是：构建一个特殊的载体，此载体所携带的正向选择标记基因本身没有自己的表达调控因子，而只能利用靶位点上相应的表达调控元件来启动表达，从而发挥选择标记的作用。根据所用的表达调控元件的不同，此法又可分为无启动子筛选法和无Poly(A)筛选法。 2. 正负筛选法（positive and negative selection, PNS） 这是目前最为常用的方法。正负筛选法的基本方法是：构建一种特殊的载体，该载体含有一段与靶基因同源的序列，在这段序列的某一外显子中插入Neo基因作为正选择标记；在同源序列之外的3’末端，或3’，5’两个末端接上单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶HSV–TK基因的序列作为负筛选标记。经酶切后使载体线性化，然后导入细胞中，进行体外培养，并以药物G-418和GANC作双重筛选。 图2：正负选择载体的筛选原理 Ⅰ：正负选择DNA；Ⅱ：染色体DNA；Ⅰ、Ⅱ之间斜线部分为同源区； A、B：染色体上的两个基因 E：外源基因； neo：G418抗性基因，即正选择基因；HSK-TK：负选择基因 3. PCR 筛选法 PCR法就是选择性地扩增发生同源重组的DNA片段。发生同源重组时，由于两个引物分别从相对的两个方向同时扩增，结果是DNA片段的拷贝数以指数形式增加，得到已知长度的DNA双链片段。与之相反的是，在随机整合中，由于只有一个引物且为单方向，所以扩增的片段拷贝数呈线性比例，片段为单链，长度不定。运用PCR法进行筛选时，必须对每个细胞克隆分别进行扩增，因此较为费时费力。 基因打靶的必备条件 1. 胚胎干细胞(ES细胞)：取自小鼠受精卵发育第4、5天的胚泡细胞 。特点：能在体外培养，保留发育的全能性。 2.打靶载体 Neo 阳性筛选标志： 新霉素抗性基因，neor基因插入用于打靶的外源DNA中（一个启动子缺失的正向选择基因 neo neomycin ），当重组后neo 基因也被插入到染色体，因此发生同源重组的ES细胞能在含G418的培养基中生长。（同源重组） HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒（herpes simplex virus）的胸腺嘧啶激酶（thymidine kinase）基因，该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。 （鉴别非同源重组） 将HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列 中。当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发 生同源重组时，载体部分(含HSV-tk基因)是不 能被整合到染色体中的。 如果ES细胞在此种培养基中被杀死，说明含 有HSV-tk基因载体部分插入基因组。可能发生 非同源重组。 如果细胞能在含单核苷酸类似物的培养基上 生长，说明含有HSV-tk基因载体部分没有重组 到染色体中；可能发生同源重组。 基因打靶的必备条件 随机整合 同源重组 （一）首先要获得并体外培养胚胎干细胞； （二）构建基因打靶载体：把目的基因及其调控序列等与内源靶序列同源的序列，都重组到带有标记基因的载体上； （三）用电穿孔或显微注射等方法将打靶载体（重组体）导入ES细胞； （四）重组体转染的ES细胞的鉴定； 基因敲除的基本程序 （五）ES细胞胚胎移植和嵌合体杂交育种：通过显微注射或者胚胎融合的方法将经过遗传修饰的胚胎干细胞引入受体胚胎内，经过遗传修饰的胚胎干细胞仍然保持分化全能性，可以发育为嵌合体动物的生殖细胞。使得经过修饰的遗传信息经生殖系统遗传，最终获得的带有特定修饰的突变体动物为研究者提供了一个特殊的研究体系，可以在生物活体中研究特定基因的功能。 基因敲除的基本程序 基因敲除的基本程序 1 、构建打靶载体 2. 将打靶载体导入ES细胞 选取发育第4-5天的胚胎干细胞(ES) ， 将打靶载体导入胚胎干细胞。通过打靶载体上的目的基因的同源序列与染色体组上的待敲除基因发生重组置换，以载体上的neo基因置换ES细胞基因组的目的基因，从而得到丧失了目的基因的ES细胞（基因敲除细胞；同源重组）。一般多采用显微注射法将打靶载体导入ES细胞。并筛选打靶成功的阳性细胞——基因敲除细胞。 3 、将基因敲除ES细胞注射入胚泡中，使其原胚泡中的细胞共同组成胚泡的内细胞团，形成嵌合胚胎。 4 、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫中。 5 、嵌合体的杂交育种 把胚胎注入假孕小鼠 Southern印记 把细胞注入胚泡 6、杂和小鼠（+/-）间杂交