09-临床生化检验技术概论.pptx

临床生化检验技术 第一节 光谱分析技术 第二节 电化学分析 第三节 电泳技术 第四节 层析技术 第五节 离心技术 主要内容 3 第一节 光谱分析技术 一、光谱技术的分类 二、分光光度技术的基本原理 三、分光光度计的基本结构 四、分光光度计的操作方法 五、分光光度技术的定性和定量方法 六、火焰光度法 七、其他光谱技术 4 光谱分析技术原理： 利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。 光谱分析技术分类： 发射光谱分析技术：火焰光度法、原子发射光谱法和 荧光光谱法 吸收光谱分析技术：紫外、可见光分光光度法，原子 吸收分光光度法和红外光谱法 散射光谱分析技术: 比浊法 一、光谱技术的分类 5 二、分光光度技术的基本原理 （一）吸光度与透光度 A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I 当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，即： T = I/I0 T×100为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即： 6 （二）Lambert-Beer定律 Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其 表达式为： A = KLC 式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液 层厚度，称为光径；C为溶液浓度 （Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和 均匀非散射的液体。） 7 据Lambert-Beer定律，当液层厚度为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数(ε)。ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。 8 （三）偏离Lambert-Beer定律的因素 应用Lambert-Beer定律产生误差主要来源于光学 和化学两方面的因素。 1．光学因素： 要求入射光是单色光。入射光的谱带越宽，其误差越大。 2．化学因素： 浓度、pH、溶剂和温度等因素可影响化学平衡。 9 三、分光光度计的基本结构 最常用的是可见分光光度计和紫外-可见光分光光度计 光源 单色器 比色杯 检测器 显示器 五大部份 结构： 10 （一）光源 光源定义： 指一种可以发射出供溶液或吸收物质选择性吸收的光。光源应在一定光谱区域内发射出连续光谱，并有足够的强度和良好的稳定性，在整个光谱区域内光的强度不应随波长有明显的变化。 光源种类： 可见光分光光度计常用光源是钨灯或卤钨灯。 紫外光光度计常用氢灯作为光源。 11 （二）单色器 定义： 将来自光源的复合光分散为单色光的装置称为分 光系统或单色器。 种类： 滤光片 棱镜 光栅 12 （三）比色杯 又称为吸收池或比色皿 材料： 常用无色透明、耐腐蚀和耐酸碱的玻璃或石英材料做成 （五）显示器 （四）检测器 检测器是将透过溶液的光信号转换为电信号，并将电信号 放大的装置。常用的检测器为光电管和光电倍增管。 是将光电管或光电倍增管放大的电流通过仪表显示出来的 装置。 13 四、分光光度计的操作方法 （一）分光光度计的基本操作 以721-A型分光光度计为例，其基本的操作步骤为： 1.开721-A分光光度计的开关，将比色池的盖子打开，通电20分钟使仪器预热。 2.将波长旋至测定的波长。 3.将空白液、校准液或待测液放入比色池，将空白液置于光路中。 4.将开关置于T位，打开比色池盖子，用光量粗调和光量细调调节T为0.0,关上 比色池盖子，调节T为100.0。 5.将开关置于A，用消光调零调节A为0.0 6.重复步骤4和5 7.将校准液或待测液推入光路，测量溶液的吸光度（A） 14 （二）吸光度的校正 铬酸钾的标准液可用于校正分光光度计的吸光度。在25℃，将4mg铬酸钾溶于100ml的0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波长下测定吸光度值，与己知的标准吸光度校正表进行比较，可检测仪器吸光度的准确度。 15 五、分光光度技术的定性和定量方法 （一）分光光度技术的定性方法 定性依据： 最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε 2.摩尔消光系数ε方法 1.最大吸收波长λmax方法 16 （二）分光光度技术的定量方法 1.标准曲线法 根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光度成正比关系。配制一系列浓度