(一)外周血单个核细胞.ppt

第二节 淋巴细胞的检测技术 一.淋巴细胞的分离 (一)外周血单个核细胞(淋巴细胞 90%)的分离 密度梯度离心法 (二）淋巴细胞亚群的分离及鉴定 1.E花环分离法： 人T细胞(表达CD2，即E受体）＋绵羊红细胞(SRBC) ? 形成E花环 ? 密度梯度离心，花环细胞沉降于管底 ? 裂解SRBC ? 获纯化T细胞 2.尼龙纤维分离法： 单个核细胞 ? 通过尼龙纤维柱 ? B细胞和单核细胞(粘附特性) T细胞(非粘附性) 3.免疫荧光法： 单个核细胞 + 抗CD3(或CD4，CD8)McAb ? +荧光素标记第二抗体 ? 荧光显微镜下鉴定CD3+T细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞 4.流式细胞术（flow cytometry, FCM）： 荧光素标记抗体＋待检细胞?单列经过FACS?分离（荧光素不同）的细胞 * FACS：荧光激活细胞分类仪(fluorescent activated cell sorter) 5.磁珠分离术： (1)直接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合抗体) + 细胞 ? 通过磁场 ? 分离磁珠结合细胞 ? +解离剂 ? 获纯化细胞 (2)间接法： 免疫磁珠(磁性微粒结合第二抗体) + 细 胞 + 抗体 ? 通过磁场 ? 分离磁珠结合细胞 ? +解离剂 ? 获纯化细胞 二. 淋巴细胞的功能测定技术 （一）体外法 1．淋巴细胞增殖试验 （1）T细胞增殖试验（T淋巴细胞转化试验） ① T细胞 + PHA ? 培养，淋巴母细胞转化 ? 染色 ? 计数转化细胞百分率 ② T细胞 + PHA ? 培养，淋巴母细胞转化 + 3H-TdR ? 测定cpm值 ③ T细胞 + PHA ? 培养，淋巴母细胞 + MTT ? 测定OD值 （2）B细胞增殖试验 B细胞 + LPS ? 淋巴母细胞 + 3H-TdR ? 测定cpm值 ② 乳酸脱氢酶(LDH)释放法 靶细胞(YAC-1细胞) + 效应细胞(小鼠脾胞)? LDH释放 + LDH底物(氧化型辅酶I、吩嗪二甲酯硫酸 盐和硝基氯化四氮唑蓝)? 形成甲基化合物(色)? 测定OD570值 NK细胞毒活性(%)= ?100% (2) 细胞毒性T细胞(CTL)杀伤功能测定 靶细胞(51Cr-EB病毒转化的B细胞) + 淋巴细 胞 + 抗CD3 mAb ? 培养 ?取上清液(含 51Cr)?γ计数器测cpm值 细胞毒效应(%)= ?100% 3. 酶联免疫斑点法 抗原包被 ? B细胞 ? 抗体产生并附着 ? 第 二抗体(酶标记)? 底物 ? 显色 抗体(抗细胞因子)包被 ? + T细胞 ? 产生细 胞因子并与抗体结合 ? + 第二抗体(酶标记)? 底 物 ? 显色 （二）体内法 抗原定量注入皮内，48～72小时后观察结果。 结果判定： 阳性：注射局部出现红肿、硬结，直径0.5cm 弱阳性：硬结直径0.5cm 阴性：无变化 实际意义： 阳性 —— 细胞免疫功能正常者 弱阳性或阴性 —— 多为细胞免疫功能低下者 * 常用的抗原为结核菌素(OT) 、PHA * * (密度为1.077) (2000rpm,15min) T细胞亚群分离－花环试验 流式细胞仪 2.细胞毒试验 (1) NK细胞的细胞毒活性测定 ① 放射性核素释放法 放射性核素标记靶细胞(K562细胞) + 效应细胞 ? 培养 ? 靶细胞破坏，释放放射性核素 ? 测cpm 值 NK细胞毒活性(%)= ?100% 实验孔cpm值-自然释放孔cpm值 最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值 实验孔OD值-自然释放孔OD值 最大释放孔OD值-自然释放孔OD值 实验孔cpm值-自然释放孔cpm值 最大释放孔cpm值-自然释放孔cpm值 *