微生物学实验复习讲解.docx

实验一无菌操作技术【用接种环挑取菌种】左手持细菌斜面培养物，右手持接种环，将接种环进行火焰灼烧灭菌（烧至发红），然后在火焰旁打开斜面培养物的试管帽（管帽不能放在桌上），并将管口在火焰上烧一下；在火焰旁，将接种针轻轻插入斜面培养物试管的上半部（此时不要接触斜面培养物），至少冷却5s后，挑取少许培养物（菌苔）后，再烧一下管口，盖上管帽并将其放回试管架中；用左手迅速从试管架上取出A管，在火焰旁取下管帽，管口在火焰上烧一下，将沾有少量菌苔的接种环迅速放进A管斜面的底部（注意：接种环不要碰到试管口边）并从下到上划一直线，然后再从其底部开始向上作蛇形划线接种。完毕后，同样烧一下试管，盖上管帽，将接种环在火焰上灼烧后放回原处。如果是向盛有液体培养基的试管和三角烧瓶中接种，则应将挑有菌苔的接种环首先在液体表面的管内壁上轻轻摩擦，使菌体分散从环上脱开，进入液体培养基中。实验二培养基的制备消毒与灭菌【培养基配制实验原理】培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。【培养基配制要素】营养：碳源、氮源、能源、生长因子、水分和无机盐；适宜的酸碱度和一定缓冲能力；一定的氧化还原电位。【培养基的分类】根据培养基成分，可分为天然培养基和合成培养基（天然培养基主要成分是复杂的天然有机物质，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基、LB等；合成培养基用化学成分完全了解的纯化合药品配制而成的培养基，如高氏一号培养基和查氏培养基）。根据物理状态，可分为固体培养基（加入凝固剂，如1.5%~2.0%琼脂）、半固体培养基（加入少量凝固剂，如0.2%~0.7%琼脂）、液体培养基（不含任何凝固剂）。根据培养基用途，可分为基础培养基（如牛肉膏蛋白胨培养基）、营养培养基（加富培养基）（添加了血清、血液等）、鉴别培养基（含有特定化合物或试剂。某种微生物在这种培养基上培养后，它所产生的某种代谢产物与这种特定的化合物或试剂能发生某种明显的特征性反应，根据这一特征性反应可以将某种微生物与他种微生物区别开来。如酪素培养基、伊红美蓝培养基）、选择培养基（利用微生物对某种化学物质的敏感性不同。在培养基中加入这类物质，抑制不需要的微生物生长，而利用所需分离的微生物生长，从而达到分离或鉴别某种微生物的目的。如无氮培养基、马丁氏培养基）。[加富培养基与选择培养基的区别]加富培养基是用来增加所要分离的微生物的数量，使其形成生长优势，从而分离到该种微生物；选择培养基则一般是抑制不需要的微生物的生长，使其需要的微生物增殖，从而达到分离所需微生物的目的。【培养基制备步骤】称量，溶化，补充水分、调pH，过滤，分装，加塞，包扎，灭菌，搁置斜面，无菌检查。【培养基制备注意事项】称量药品时，严防药品混杂。称完一种药品后需要将牛角匙洗净、擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。药品不要弄错。如：K2HPO4和KH2PO4、水合形式和无水形式的化合物要注意分辨。培养基中多种无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将两种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。对于微量成分，可以先配制成高浓度的储备液，按比例换算后再加入。琼脂溶化过程中，要控制火力并不断搅拌，以免沸腾溢出或琼脂糊底烧焦。不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基。调pH值前先补足水分。pH不要调过头，以免回调影响离子浓度。固体分装不超过试管高度的1/5，不超过三角烧瓶容积的一半。分装过程中，注意不要将培养基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起的污染。配好培养基后要贴上标签，写清培养基类型、组别、配置时间。【消毒与灭菌】消毒是指采用物理、化学和生物的方法消除物体的表面病原菌和有害微生物营养体的过程。灭菌时指采用物理、化学和生物的方法杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子的过程。加热灭菌：（1）干热灭菌：利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的，有火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种。（2）湿热灭菌，0.1MPa，121℃，15~30min。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧将锅内冷空气从排气阀中趋尽，关闭排气阀，继续加热。由于水蒸气无法排出，增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。（细胞内蛋白质的凝固性与其含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内的含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高，160~170℃，时间要长，1~2h，但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包裹器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。）[在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大]原因