non-coding RNA——现代分子生物学课程.pptVIP

RISC：RNA-Induced Silencing Complex 一种多结构域的双链RNA专一性RNase Ⅲ miRNA如何行使功能？ 与mRNA的3‘端非编码区特定位点(其第2~8个核苷酸)绑定： 与mRNA完美互补时——会引发mRNA降解； 不完美的与mRNA配对时，会引发转录后的基因沉默（抑制靶基因的表达） 从而抑制或阻止相应的mRNA翻译过程。 举例分析：在DNA修复通路中行使上述过程 1）抑制或阻止正常细胞DNA修复产生致癌作用 2）抑制或阻止癌细胞DNA修复达到治疗效果 植物miRNA 的特点 植物miRNA与动物miRNA的相类似特点 (1)miRNA广泛存在于真核生物中。 (2)miRNA 的长度约为20～24 nt。 (3)miRNA 没有开放阅读框(ORF)及蛋白质编码基因特点。 (4)miRNA的基因成簇性。 (5)miRNA 的保守性。 植物miRNA 的特点 植物miRNA与动物miRNA的相类似特点 (6)miRNA表达的时空特异性。 (7)几乎所有的miRNA从前体的1条臂中加工而来。 (8)miRNA 的5 端多以U 开头 。 植物miRNA 的特点 植物miRNA与动物miRNA的不同特点 (1)植物miRNA前体的大小变化较大，一般为64～303 nt，而动物miRNA前体的变化较小，一般为60～75 nt。 (2)植物中的miRNA较动物中的更为保守，它们与互补序列的错配数也少于动物。 植物miRNA 的形成 miRNA成熟所需的酶类 一种多结构域的双链RNA专一性RNase 1II(Dicer酶、类Dicer酶)和Argonaute蛋白。 Dicer酶包含4种结构域：RNA解旋酶结构域、PAZ(Piwi—ArgonauteZwille)结构域、2个RNaseⅢ结构域和dsRNA结合结构域(dsRBD) Argonaute蛋白具有PAZ和PIWI结构域 。 植物miRNA 的作用机制 miRNA的作用方式可根据其与靶基因的互补程度不同而分为两种：转录产物裂解和翻译抑制。 a.当miRNA与靶mRNA完全互补或接近完全互补时，则会切割mRNA； b.当植物miRNA与靶mRNA不完全互补时，则抑制其翻译。 近年来研究发现，miRNA也可以通过目标染色体位点的甲基化，或通过调控靶mRNA的定位或稳定性在转录水平上发挥作用。 植物miRNA 的功能 1 抗生物胁迫 植物中存在一类miRNA与多种植物病毒基因完全或不完全互补，推测这类miRNA 可通过切割病毒基因抑制病毒侵染。 2 抗非生物胁迫 2．1 抗营养胁迫 (1)调节植物磷代谢平衡 Chiou 发现，在磷胁迫下，拟南芥中miR399大量表达；而在高磷条件下，未检测到miR399的表达。 (2)调节植物硫代谢平衡 miR395在高硫条件下不表达，在硫缺失胁迫下表达 。 植物miRNA 的功能 2 抗非生物胁迫 2．2 抗环境胁迫 miRNA可以使植物抵抗寒冷、高浓度ABA、干旱、高盐等极端自然环境 及抵抗环境引起的自身氧化胁迫 。 miRNA的检测 miRNA的获取 miRNA的确认 miRNA的检测方法 miRNA的获取 miRNA 分子的序列短小 1）在基因组中存在较多的互补序列 2）在不同生物体内与靶基因结合的方式也不尽相同 3）通常与多种蛋白相互作用 这使得建立一个有效而且普遍适用的研究方法异常困难。 #到目前为止,miRBase上公布的miRNA总数将近3 000种。 #现在已知靶基因的miRNA多是通过基因克隆和生物信息学筛选的方法发现的。 miRNA的获取——基因克隆 1.1　基因克隆　 直接克隆的方法通常是从总RNA中提取大约22 nt的小RNA分子,制备一个小RNA的cDNA(complementary DNA)文库。将文库中的小RNA序列与基因组数据库中BLAST序列类似性 比对,排除非miRNA 序列后,通过Northern印迹方法(Northern blotting) 得到最终确认。目前大量的已知miRNA都是通过这种方法获得的。 　　基因克隆方法的优点是对于高丰度或常表达的基因来说,可以获得完整的miRNA序列。然而对于另一些miRNA,它们在生物体内浓度很低(表达量低或表达产物极不稳定,或前体到成熟的加工效率低等原因引起) ,或者某些只在生物体的特定时期或特定组织器官中表达,直接克隆法则无法获取。 注：Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 miRNA的获取——生物信息学筛选 1.2　生物信息学筛选 　随着生物全基因组测序的完成,利用计算机对基因组序列进行有哪些信誉好的足球投注网站可以大大